Gener kan manipuleres under utviklingen av hjernebarken eller hippocampus av rotte via in utero electroporation (iue) på E16, for å muliggjøre rask og målrettede endringer i nevronale tilkobling for senere studier av atferd eller nevropatologi hos voksne dyr. Postnatal in vivo avbildning for kontroll av IUE suksess er utført av bioluminescens for aktivering co-transfektert luciferase.
I utero electroporation (iue) er en teknikk som gjør at genmodifisering av celler i hjernen for å undersøke nevronale utvikling. Så langt, har bruken av iue for å undersøke atferd eller nevropatologi i den voksne hjernen er begrenset av utilstrekkelige metoder for overvåking av iue transfeksjon suksess ved ikke-invasive teknikker i postnatal dyr.
For denne studien, ble E16 rotter brukes for iue. Etter intraventrikulær injeksjon av nukleinsyrene til embryoene, anbringelse av pinsetten elektroder var kritisk for målretting enten den tredje cortex eller hippocampus.
Ventrikulær co-injeksjon og elektroporering av et luciferase-genet tillot kontroll av de transfekterte cellene postnatalt etter intraperitoneal injeksjon luciferin i bedøvet levende P7 pup ved in vivo bioluminescens, ved hjelp av en IVIS spektrum enhet med 3D kvantifisering programvare.
<pclass = "jove_content"> Område definisjon av bioluminescens kunne tydelig skille mellom kortikale og hippocampus electroporations og detektere et signal lengde over tid opp til 5 uker etter fødselen. Dette imaging teknikken tillot oss å velge unger med et tilstrekkelig antall transfekterte celler antas nødvendig for å utløse biologiske effekter, og senere, for å utføre atferds undersøkelser ved tre måneders alder. Som et eksempel, denne studien viser at IUE med humant full lengde DISC1 genet i rotte cortex ført til amfetamin overfølsomhet. Kotransfiseres GFP kunne påvises i nevroner etter post mortem fluorescens mikroskopi i cryosections indikerer genuttrykk stede på ≥ 6 måneder etter fødselen.Vi konkluderer med at postnatal Bioluminescens bildebehandling tillater evaluere suksessen til forbigående transfections med iue hos rotter. Undersøkelser på påvirkning av aktuelle genet manipulasjoner under neurodevelopment på den voksne hjernen og dens tilkobling er mye lettere. For mange vitenskapelige spørsmål, kan denne teknikken supplere eller erstatte bruk av transgene rotter og gi en ny teknologi for atferdsnevrovitenskap.
Utviklingen av den i utero electroporation (iue) metode som lar en modulering av genekspresjon i utviklingen av hjernen, har vært et gjennombrudd fordi det aktivert studere neurodevelopment med relativ letthet. 1-7 Endringer i uttrykk nivåer av et mål gen i en bestemt hjernen regionen under embryonal og / eller perinatal utvikling hos gnagere ble demonstrert til kritisk innflytelse nevronale spredning, migrasjon, arborization, og tilkoblingsmuligheter. 8-10
Schizofreni er en kompleks mental sykdom med akutte og kroniske symptomer som er relatert til nevrologiske abnormiteter 11, 12 og derfor er mange av de identifiserte kandidatgener for schizofreni er undersøkt for potensielle stimulerende effekter på neurodevelopment, som for eksempel for den forstyrret-in-schizofreni -1 (DISC1) genet 13-15.
Hjernens utvikling er regulerted av genetiske faktorer og deres samspill med miljøet som spiller roller i pre-, peri-og postnatal utviklingsperioder. En stor genetiske risikofaktoren for forskjellige adferdsforstyrrelser er de DISC1 16 genet. DISC1 knockdown fører til migrasjon defekter i mus 13, 17, og manipulering av DISC1 ekspresjon i den tredje cortex ved IUE har vist seg å påvirke virkemåten til voksne mus 18.
Manipulere hjernen genuttrykk ved iue har flere fordeler 19 over generasjon av transgene dyr linjer. Først, er genuttrykk innenfor områder av interesse oppnådd i løpet av uker til måneder i stedet for flere generasjoner av avl transgene gnager linjer. For det andre er kompensatoriske mekanismer under tidlig utvikling som kan skjerme for fenotyper i germline-konstruert dyr 20 unngått. Tredje, gjennom målretting bare en bestemt cellepopulasjon eller bestemt område av hjernen, migratipå eller spredning forskjellene kan direkte sammenliknet med ikke-mutant eller styre motsatt side hvis ensidige electroporations er valgt. På den annen side, ikke IUE ikke nøyaktigheten av promoter-drevet cre / lox-indusert tidspunkt for ekspresjon, og bare en subpopulasjon av celler innen et visst område er rettet fører til en mosaikk form av genekspresjon mønster.
For mange eksperimentelle anvendelser i voksne rotter, kan en forbigående transfeksjon av et begrenset antall celler i et hjerne-regionen være tilstrekkelig, eller til og med ønskelig, slik at den store fordelen av stabile, germline-transgen gnagere er ubetydelig. Faktisk er iue nyttig å undersøke om noen unormalt utviklede celler kan påvirke et helt nettverk av celler eller kretser. En annen fordel kan være evnen til å påvise ikke-celle-autonome virkninger av et gen på grunn av den mosaikk arten av treffet. Videre er den generasjonen av transgene og knockout rotter fortsatt i sin barndom og brukav iue i denne arten for å studere avvik hjernens utvikling konsekvensene er av høy interesse.
Så langt, er et stort hinder for å bruke iue for å undersøke intervensjons konsekvenser i de dyrene som voksne mangel på overvåking elektroporering suksess. Hittil GFP-co-transfektert fluorescerende nevroner i live nyfødte rotteunger ble ikke detektert under en passende kikkert fluorescens mikroskop eller med fluorescens-avbildning av IVIS spektrum.
For å overkomme denne hindringen, vi kotransfiseres en luciferase reporter gen og utført Bioluminescens direkte avbildning av unger etter 3-dimensjonale (3D) kvantifisering av iue hjerneområde.
Som et eksempel for å demonstrere anvendeligheten av denne metode i en senere funksjonelt assay tester nevrologiske genetisk manipulering, et ko-injeksjon av plasmider inneholdende human DISC1, luciferase, og GFP inn i den laterale ventrikkel i rotteembryoer <sup> 3 etterfulgt av elektroporering med en pinsett-elektroden ble utført. Mens fluorescens-signaler ikke kunne påvises i postnatal stadier in vivo, ble et fast stoff bioluminesens signal utledet fra luciferin metabolisme av co-transfektert luciferase genet detektert opp til fem uker etter fødselen. 3D-målinger av electroporated hjernen området tillatt kvantifisering der unger med manglende eller feilplassert elektroporering ble identifisert fra begynnelsen, og dermed, slik at tildeling av IUE dyr (genet av interesse og egge kontroll) til eksperimentelle grupper med matchet electroporated hjernen områder med lav variabilitet . Bruken av voksne IUE rotter i atferds paradigmer ble vist som et eksempel på nytten av denne protokoll.
Vårt studium viser at IUE er egnet til å generere voksne rotter med nevroner uttrykke et transgen i en selektiv område av hjernen, og at, som et resultat av dette inngrep, disse dyrene oppviser endringer i oppførsel som indikerer funksjonaliteten til utførte manipulasjon. I denne studien, som et eksempel, rotter overekspresjon DISC1 unilateralt i en liten del av den prefrontale cortex viste overfølsomhet mot amfetamin (figur 9).
Velge rotter for elektroporering suksess ved in vivo Bioluminescens bildebehandling var effektiv i å kontrollere for den iboende variabilitet iue celle transfeksjon og ble brukt til å generere grupper med en homogen iue område med lav inter-individuell variabilitet for senere undersøkelser.
I denne studien, var vi ikke i stand til å velge elektroporert valper fra kullet ved påvisning av co-electroporated GFP-indusert fluorescens i den nyfødte dyr, selv thohuff på samme tid og i samme dyr en Bioluminescens signalet fra like co-electroporated luciferase kunne påvises etter luciferin injeksjon (figur 6), og som uttrykker GFP neuroner var fortsatt til stede i hjernen til en alder på seks måneder. Vi konkluderer med at det i rotte, er luciferase / luciferin reaksjonen godt egnet til å skille dyr med vellykkede electroporated hjerne (figur 3).
Den kvantitative overvåking av IUE suksess vedrører styrken Bioluminescens signal som er målt ved de tellinger av fotoner innenfor samme eksponeringstid (figur 3), og tilsvarer den enzymatiske aktivitet av co-uttrykt luciferase. Små Bioluminescens signaler kan påvises ved 100-200 tilfeller av fotoner, og, på en utstråling av ~ 1×10 4 fotoner / sek / cm 2 / steradian showet 1000-2000 GFP-farget celler i histologi i seks måneder gamle rottehjernen. Den høyeste signal displegges en utstråling av opptil ~ 5×10 6 fotoner / sek / cm 2 / steradian og ~ 64 000 tellinger.
I Sprague Dawley rotte belastning anvendes, observerte vi en svekkelse av Bioluminescens signal i lengderetningen med økende alder, og signalet forsvant utover fylte P35 (figur 4). På dette punktet, vet vi ikke om enten forbigående, plasmidvektor baserte uttrykk for luciferase reduseres, eller hvis Bioluminescens signalet svekkes på grunn av økende hjernemasse, eller begge er årsakene til den forsvinner signalet. For den foreliggende funksjonelt assay i voksne rotter, ble seleksjonen for Adferdsstudier bare laget basert på plasseringen av signalet, men ikke av signalstyrke Bioluminescens.
Selv om 3D kvantitativ Bioluminescens overvåking tillatt differensiering mellom ulike electroporated områder (figur 5), var dens accurateness begrenset til celler som ligger i dybden kronension av hjernen. Figur 6 viser et eksempel på en hippocampal electroporation hvor Bioluminescens målingen i 2D-og 3D-bilde indikerte en god posisjonering av elektroporering. I dissekert post mortem hjernen, ble en GFP-fluorescens signal oppdages på omtrent samme posisjon som Bioluminescens signal, som indikerer riktig målretting av hippocampus. Men histologiske viser også at cellene i cortex dorsal hippocampus hadde blitt rettet (fig. 7). Dette indikerer at Bioluminescens analysen er et nyttig verktøy for å oppdage positive, IUE valper, og også å ha en idé om electroporated området, men til syvende og sist kan bildebehandling ikke erstatte post mortem histologi å nøyaktig lokalisere positivt målrettede celler.
Vår demonstrasjon viser løftet for anvendelsen av iue teknologi for å generere subtile målrettede manipulasjoner av kortikale eller hippocampus områder av hjernen til å simulere aberrances i cortical migrasjon eller andre nevrologiske defekter som kan påvirke den voksne dyr. Mens bilateral electroporation 26 har fordelen av en større sannsynlig effekt på virkemåten, er det også mer dødelighet av embryoer. Unilateral elektroporering ble valgt for å sammenligne de to halvkuler med en som en intern kontroll, og for å vise at selv IUE manipulering i en ensidig, lite område er tilstrekkelig til å endre virkemåten. Iue-induserte endringer i tilkobling eller arkitektur mellom nevroner kan dermed fremkalles uten fremkaller en lesjon og den nødvendige kampen i å-være-iue-manipulert regionen med den aktuelle atferds testen er avhengig av vitenskapelige spørsmål.
Feilsøking
Redusert kullstørrelse Det er flere forslag om å øke overlevelsen av de IUE valpene. Først, ved bruk av meget tynne glasskapillærer på elektroporering for å minimalisere vevet lesion er anbefalt. For det andre, ikke electroporate den første embryo ved vaginal slutten av hver livmor horn: døden av den førstefødte fosteret øker sjansene for en abort av alle andre embryoer. Tredje, etter fødselen, mor rotter ofte drepe en del av deres avkom på grunn av perinatal stress. For å redusere ekstra stress, ikke begynn med direkte avbildning rett etter fødselen, men vente i sju dager.
GFP-fluorescens deteksjon av valpene
På en uke etter fødsel, noe signal av fluorescens ved enten å bruke levende kikkert fluorescens mikroskopisk bildebehandling eller fluorescens bildebehandling med IVIS Spectrum (epifluorescence og transfluorescence moduser; for GFP eksitasjon / utslipp: 465/520 nm og 500/540 nm). Det er mulig at både den begrensede overføring av kort bølgelengde eksitasjon og emisjon lys gjennom vevet som skallen og den høye autofluorescens bakgrunn av huden hindre ved hjelp av fluorescens under described forholdene i rotte. Som vist i figur 6, kan den luciferase-signalet i det levende dyr, som også kan påvises i den dissekerte hjerne (uten skallen) og der også en fluorescens-signalet er påvisbar (figur 6D).
Differensiering av bioluminescence i tett linjeavstand hjerneområder
Selv i 3D-illustrasjon av plasseringen av Bioluminescens område som ikke kan forutsies til 100%. Spesielt celler oppå eller under av den anslåtte området kan også være et uhell målrettet og transfektert. Den nøyaktige posisjon må bli kontrollert av post mortem (fluorescens) histologi (se figur 7).
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Tracy Young-Pearse og Atsushi Kamiya for å gi plasmider.
Dette arbeidet ble finansiert av Neuron-Eranet Discover til OR og CK (BMBF 01EW1003), DFG (Ko 1679/3-1, GRK1033) til CK, og (DE 792/2-4) til MASS
Reagent name | |||||||||||||||||||||||||||||||
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Invitrogen | 14190-250 | without calcium, without magnesium | ||||||||||||||||||||||||||||
D-luciferin, sodium salt | SynChem OHG, Germany | BC218 | CAS number: 103404-75-7 substrate for firefly-luciferase | ||||||||||||||||||||||||||||
Fast Green FCF | Sigma Aldrich, USA | F7258-25G | CAS: 2353-45-9 | ||||||||||||||||||||||||||||
D-Amphetamine | Sigma Aldrich, USA | A 5880 | CAS: 51-63-8 | ||||||||||||||||||||||||||||
kodan Tinktur forte | Schülke & Mayr GmbH, Germany | 104 005 | |||||||||||||||||||||||||||||
Material / product | |||||||||||||||||||||||||||||||
Glass capillaries | Sutter Instrument | Novato, California, USA | borosilicate glass O.D.:1 mm, I.D.: 0.78 mm | ||||||||||||||||||||||||||||
Needle Pipette Puller | David Kopf Instruments | Tujunga, California, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
Tweezer electrode | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | 7 mm in diameter platinum disc electrodes (CUY650P7) | ||||||||||||||||||||||||||||
Surgical Scissors – sharp | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Straight, 12 cm (14002-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Ring Forceps | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | 2.2 mm ID, 3 mm OD (11021-12) | ||||||||||||||||||||||||||||
Square wave pulse electroporator (CUY21SC) | Nepa Gene CO., LTD. | Shioyaki, Ichikawa, Chiba, Japan | (CUY21SC) | ||||||||||||||||||||||||||||
Vicryl surgical suture material | Ethicon | Norderstedt, Germany | 3-0; 2 Ph. Eur; | ||||||||||||||||||||||||||||
Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | Heidelberg, Germany | Reflex 9 mm (12032-09) | ||||||||||||||||||||||||||||
Syringe filter | VWR | Darmstadt, Germany | 0.45 μm cellulose acetate | ||||||||||||||||||||||||||||
IVIS Spectrum | Caliper Life Science / PerkinElmer | Waltham, MassachusettsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
XGI-8 Gas Anesthesia System | PerkinElmer | Waltham, Massachuset tsUSA | |||||||||||||||||||||||||||||
Open-field | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | (40 x 40 x 39 cm) | ||||||||||||||||||||||||||||
Tru Scan activity system | Coulbourn Instruments | Allentown, USA | |||||||||||||||||||||||||||||
|