In vivo to-foton billedbehandling af oplevelsesbaseret afhængige molekylære ændringer i kortikal neuroner

Summary

Erfaring-afhængige molekylære forandringer i neuroner er afgørende for hjernens evne til at tilpasse sig i svar til adfærdsmæssige udfordringer. En<em> In vivo</em> To-foton billedbehandling metode er beskrevet her, der gør det muligt at spore sådanne molekylære ændringer i de enkelte kortikale neuroner gennem genetisk kodede journalister.

Abstract

Hjernens evne til at ændre sig som svar på erfaring er afgørende for en sund hjernefunktion, og abnormaliteter i denne proces bidrager til en række forskellige hjernesygdomme ^1,2. For bedre at forstå de mekanismer, der hjernens kredsløb reagerer på et dyrs oplevelse kræver evne til at overvåge erfaring-afhængige molekylære forandringer i et givent sæt af neuroner, der over en længere periode, i det levende dyr. Mens erfaring og tilknyttede neurale aktivitet er kendt for at udløse genekspression ændringer i neuroner ^1,2, til de fleste af metoderne detektere sådanne ændringer ikke tillader gentagen observation af de samme neuroner over flere dage eller ikke har tilstrækkelig opløsning til at se individuelle neuroner ^{3 , 4.} Her beskriver vi en fremgangsmåde, der kombinerer in vivo to-foton mikroskopi med en genetisk kodet fluorescerende reporter at spore erfaringer-afhængig genekspression ændringer i individuelle corticale neuroner over løbet af dag-til-dag oplevelse.

Et af de veletablerede erfaring-afhængige gener er Activity-regulerede cytoskeletal associeret protein (Arc) ^5,6. Transskriptionen af Arc er hurtigt og yderst induceret af intensiveret neuronal aktivitet ³ og dens proteinprodukt regulerer endocytose af glutamatreceptorer og langsigtet synaptiske plasticitet ^7. Ekspressionen af lysbuen er almindeligt anvendt som en molekylær markør til kortlægning neuronale kredsløb er involveret i specifikke adfærd ^3. I de fleste af disse undersøgelser blev Arc ekspression detekteres ved in situ-hybridisering eller immunohistokemi i faste hjernesnit. Selv om disse metoder viste, at ekspressionen af ​​Arc blev lokaliseret til en delmængde af excitatoriske neuroner efter adfærdsmæssige erfaring, hvordan de cellulære mønstre af Arc udtryk kan ændre sig med flere episoder af gentagne eller særprægede oplevelser over dage blev ikke undersøgt.

ntent "> In vivo to-foton mikroskopi tilbyder en kraftfuld måde at undersøge erfaringerne-afhængige cellulære ændringer i den levende hjerne ^8,9. For at undersøgelsen af Arc udtryk i levende neuroner ved to-foton mikroskopi, vi tidligere genererede et knock- i muse linje, hvori en GFP reporter anbringes under kontrol af den endogene promotor Arc ^10. Denne protokol beskrives de kirurgiske forberedelser og billeddannende procedurer til sporing erfaring-afhængige Arc-GFP-ekspressionsmønstre i neuronale ensembler i det levende dyr. Ved denne fremgangsmåde , kroniske kranielle vinduer blev først implanteret i Arc-GFP mus over de kortikale områder af interesse. De pågældende dyr blev derefter gentagne gange afbildet af to-foton mikroskopi efter ønskede adfærdsmæssige paradigmer i løbet af nogle dage. Denne metode kan være generelt anvendelig til dyr, der bærer andre fluorescerende reportere erfaring-afhængige molekylære ændringer ^4.

Protocol

De eksperimentelle procedurer, der beskrives nedenfor, blev godkendt af National Institute of Mental Health Animal Care og brug Udvalg og var i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr. 1. Pre-operative Preparation Rengør alle redskaber i en varm perle sterilisator før aseptisk kirurgi, rense operationsstedet med 70% ethanol, og satte rene drop klude. Bær sterile handsker. Bedøve dyret med frisk fremstillet 1,2% A…

Representative Results

Denne protokol beskrives en metode til at følge erfaringer-afhængige molekylære ændringer i de enkelte corticale neuroner i levende dyr. En kronisk kraniale vindue først skabt over en kortikale region af interesse i en mus, der bærer en fluorescerende reporter for genekspression. To-foton mikroskopi kan derefter kobles med forskellige adfærdsmæssige paradigmer at observere behaviorally inducerede molekylære ændringer i individuelle neuroner og spore de ændringer i de samme sæt af neuroner over flere da…

Discussion

Den in vivo-billeddannelse her beskrevne fremgangsmåde muliggør gentagen undersøgelse af Arc genekspression ændringer i de samme sæt af neuroner over flere dage i det levende dyr. Det er en effektiv og alsidig metode til at indhente oplysninger om neurale plasticitet-relaterede molekylære dynamik i de enkelte neuroner som reaktion på forskellige adfærdsmæssige oplevelser. Standard histokemiske metoder, såsom in situ-hybridisering og immunfarvning kan opnå enkeltcelle-opløsning ^3,…

Materials

Name of the Equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
FV1000 multi-photon laser scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	Imaging
Dissection microscope	Omano	555V107	Surgery
Stereotaxis surgery stage for mice	Harvard Apparatus	726335	Surgery
20X or 25X water immersion objective	Olympus	XLPL25XWMP	Imaging
Microscope stage with head-fixation frame	Custom made	N/A	Imaging
Fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Surgery
Dental drill burr	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
CCD camera	QImaging	QICAM 12-bit	Imaging