Märkning av enstaka celler i det centrala nervsystemet hos<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Vi presenterar en teknik för märkning enstaka neuroner i det centrala nervsystemet (CNS) hos<em> Drosophila</em> Embryon, som tillåter analys av neuronal morfologi av antingen ljus eller konfokalmikroskopi.

Abstract

I den här artikeln beskriver vi hur individuellt för att märka neuroner i embryonala CNS av Drosophila melanogaster genom juxtacellular injektion av lipofila fluorescerande membran markör Dil. Denna metod medger visualisering av neuronal cellmorfologi i detalj. Det är möjligt att märka någon cell i CNS: cellkroppar mål nervceller visualiseras i DIC optik eller genom uttryck av en fluorescerande genetisk markör som GFP. Efter märkning kan Dil omvandlas till en permanent brun fläck på photoconversion att tillåta visualisering av cellmorfologi med ljus och DIC optik. Alternativt, kan de Dil-märkta cellerna observeras direkt med konfokalmikroskopi, möjliggör genetiskt införts fluorescerande reporter proteiner som skall colocalised. Tekniken kan användas i alla djur, oavsett av genotyp, vilket gör det möjligt att analysera mutanta fenotyper vid enda cell upplösning.

Introduction

Kunskap om neuronal morfologi vid enskilda celler är en viktig förutsättning för att förstå nervkopplingar och CNS-funktion. Således, från de tidigaste dagarna av neurovetenskap, har forskare försökt utveckla enskilda tekniker cell märkning (se ⁷ för en historisk behandling av denna fråga). Klassiska metoder såsom Golgi färgning ger utmärkt upplösning av neuronal morfologi men är inte lämpliga om man försöker märka en viss typ av neuron i ett riktat sätt, såsom färgning sker på ett slumpmässigt sätt. Utvecklingen av metoder för färgning enstaka celler genom intracellulära eller juxtacellular injektion av färgämnen från en mikroelektrod riktat kravet på särskild märkning.

Tillämpningen av enda neuron färgämne injektion till Drosophila en stor utmaning på grund av den lilla storleken på både organismen och dess nervceller. Trots enda neuron färgning av embryonala Drosophila </em> Neuroner uppnåddes i mitten av 1980-talet i laboratorium Corey Goodman ^15. Medan metoden har i högsta grad användbar och har gett några viktiga insikter mekanismer för neuronal utveckling i Drosophila de senaste 20-30 åren (t.ex. ^{2, 10),} har många arbetare skyggat från det, till stor del på grund av dess tekniska krav.

Tillgången på senare år av genetiska tekniker för neuronal märkning i Drosophila har också bidragit till impopularitet enda neuron färgämne injektion. GAL4-riktad uttryck av membran riktade GFP konstruktioner kan ge utmärkt upplösning av neurala morfologi ^{1, 20.} Emellertid har denna metod vissa begränsningar: det ofta oundviklig uttryck av GFP i flera celler kan skymma struktur i enskilda neuroner och en GAL4 förare linje kanske inte är tillgängliga för att driva expression i en särskild neuron av intresse. Den marcm (Mosaik analys med ett repressible cellmarkör) metod ⁸ kan ge märkning av väsentligen varje neuron på individuell cellnivå, men kan inte med framgång användas i embryot och tidig larv grund av den långsamma omsättningen av GAL80-proteinet.

Med tanke på dessa begränsningar genetisk märkning, tror vi att enda neuron färgämne injektion i Drosophila embryot fortfarande en värdefull teknik och förtjänar bredare tillämpning. För att främja detta mål, tillhandahåller vi här en detaljerad beskrivning av metoden. En illustration av sin makt ges av vår senaste hänsyn till morfologi fullständig uppsättning interneuronen i buken neuromeres av den sena Drosophila embryot ^14. Denna studie, som visade både den morfologiska variationen av individuella neuronala celltyper och principerna för neuromere organisation i CNS hos embryot, skulle inte ha varit möjligt med någon annan tillgänglig märkning metod.

Protocol

Vi har använt två något olika varianter av enda neuron märkningsmetod i våra laboratorier. Skillnaderna avser embryosamlingen, dechorionisation, devitellinisation och embryo steg filetering. Figur 1 ger en översikt över de vanligaste och divergerande steg varianterna. 1. Beredning av Micro-nålar för embryon Dissection och Mikropipetter för Dye injektion Glas nålar för embryo dissektion dras från glaskapillärer (1 mm i diameter och 0,1 mm väggtjockle…

Representative Results

Figur 4 illustrerar typiska resultat av tekniken, beskriver vi här. Figur 4A visar ett exempel på en fylld Dil enda interneuron som rent var photoconverted. Det visar fint hur mycket detaljer dessa preparat erbjuder. När den betraktas under DIC optik den rumsliga ramen för den märkta cellen inuti den icke-märkta omgivande vävnad blir synlig, t.ex. positionen av cellkroppen i cortex och av fibern utskjutande inuti neuropile. Figur 4B</…

Discussion

En stor fördel med Drosophila som ett modell-system är att det tillåter analys av utveckling och funktion på nivån av enskilda celler. Detta är särskilt användbart när det gäller nervsystemet, där mångfalden av celltyper är exceptionellt hög och funktion och morfologi av angränsande celler kan vara helt annorlunda.

Den metod som vi presenterar här tillåter märkning av enskilda neuroner med ett färgämne som antingen kan omvandlas till en permanent fläck eller und…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
			REAGENTS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde	Merck Millipore		7,4 % in PBS
Glycerol	Roth	3783	70% in PBS
Heptane Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPMENT
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2	to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	to perform the labelings
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecting Microscope	Leica	MZ8	to prepare and disect embryos
Flat Capillaries	Hilgenberg		outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries	Science Products	GB 100 TF 8P
Micromanipulator R	Leica		to perform the labelings
Model P-97	Sutter Instruments		to pull capillaries
Object Slides	Marienfeld Superior	1000000
Scientific Microscope	Zeiss	Axioskop 2 mot	to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope	Olympus	BX50	to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	to record labelings after photoconversion

Table 1.