Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Resumo

Nós apresentamos uma técnica para etiquetar neurônios no sistema nervoso central (SNC) de Drosophila Embriões, o que permite a análise da morfologia neuronal ou por luz transmitida ou microscopia confocal.

Resumo

Neste artigo vamos descrever como individualmente rotular neurônios no sistema nervoso central embrionário de Drosophila melanogaster por injecção juxtacellular do DiI marcador fluorescente membrana lipofílica. Este método permite a visualização da morfologia das células neuronais em grande detalhe. É possível marcar qualquer célula no sistema nervoso central: os corpos celulares dos neurónios-alvo são visualizadas sob óptica DIC ou por expressão de um marcador fluorescente tal como GFP genética. Após a marcação, o DiI pode ser transformado em um castanho mancha permanente por fotoconversão para permitir a visualização da morfologia das células, com luz transmitida e óptica DIC. Alternativamente, as células marcadas com DiI pode ser observada directamente em microscopia confocal, permitindo geneticamente introduzidos proteínas repórter fluorescentes a ser colocalised. A técnica pode ser usada em qualquer animal, independentemente do genótipo, tornando possível a análise fenótipos mutantes a resolução de células simples.

Introdução

O conhecimento da morfologia neuronal ao nível das células individuais é um requisito chave para a compreensão da conectividade neuronal e função do SNC. Assim, desde os primeiros dias da neurociência, os pesquisadores têm procurado desenvolver técnicas única célula de rotulagem (ver ⁷ para um tratamento histórico da questão). Os métodos clássicos, tais como a coloração de Golgi proporcionar excelente resolução da morfologia neuronal, mas não são adequados, se se procura identificar um tipo específico de neurónios de uma forma dirigida, tal como a coloração ocorre de uma forma aleatória. O desenvolvimento de métodos para a coloração de células isoladas atr....

Protocolo

Temos utilizado duas variantes ligeiramente diferentes do método único neurônio rotulagem em nossos laboratórios. As diferenças referem-se à colheita de embriões, dechorionisation, devitellinisation e passos de filetagem de embriões. Figura 1 apresenta uma visão geral das etapas comuns e divergentes das variantes.

1. Preparação de micro-agulhas de dissecção Embrião e Micropipetas para injeção Dye

1. Agulhas de vidro para a dissecação de embriões são retirados a partir de capilares de vidro (1 mm de diâmetro e 0,1 mm Espessura da parede) com um extractor Sutter (Science Instruments) ou equipamento comparável. Alter....

Resultados

A Figura 4 ilustra os resultados típicos da técnica, é descrita aqui. Figura 4A mostra um exemplo de um interneurônio DiI cheio único que foi limpa photoconverted. Ele demonstra muito bem a quantidade de detalhes estas oferecem preparações. Quando visto sob óptica DIC contexto espacial da célula marcada no interior do tecido não-rotulada envolvente se torna visível, por exemplo, a posição do corpo da célula dentro do córtex e da projecção de fibras dentro do neurópilo.

Discussão

Uma grande vantagem da Drosophila como sistema modelo é que ele permite a análise do desenvolvimento e função do nível de células únicas. Isto é especialmente útil em relação ao sistema nervoso, onde a diversidade de tipos de células é excepcionalmente elevada e a função e morfologia de células vizinhas pode ser totalmente diferente.

O método que apresentamos aqui permite a marcação de neurónios individuais, com um corante que pode ser transformada em uma mancha permanente ou examin.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Nome do reagente / Material	Companhia	Número de Catálogo	Comentários
			REAGENTES
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg / ml em 100 mM Tris-HCl, pH 7,4
DiI	Sondas Invitrogen / Molecular	D-282	1 mg / ml em etanol
Formaldeído	Merck Millipore		7,4% em PBS
Glicerina	Roth	3783	70% em PBS
Heptano Cola	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	diluir ca. 1 a 1 com n-heptano
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPAMENTOS
Microscópio confocal	Leica	TCS SP2	para visualizar e documentar bulas de fluorescência
DC - ummplifier	Dragan Corporação	Cornerstone ION-100	para executar as bulas
Lamelas	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Lamelas	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecando microscópio	Leica	MZ8	para preparar e disect embriões
Plana Capilares	Hilgenberg		diâmetro exterior 1 mm; glas espessura 0,1 milímetros
Injeção Capilares	Produtos ciência	100 GB TF 8P
R micromanipulador	Leica		para executar as bulas
Modelo P-97	Sutter Instruments		para puxar capilares
Slides objeto	Marienfeld Superior	1000000
Microscópio científica	Zeiss	Axioskop 2 mot	para ver bulas após fotoconversão
Microscópio científica	Olimpo	BX50	para executar as bulas
Câmera de vídeo Sony MC3255	Sony / AVT Chifre	Sony MC3255	para gravar rotulamentos após fotoconversão

Tabela 1.