Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS) sunmak<em> Drosophila</em> Geçen ışık veya konfokal mikroskopi ya tarafından nöronal morfoloji analizi sağlar embriyolar,.
Abstract
Bu yazıda tek lipofilik floresan membran işaretleyici DII arasında juxtacellular enjeksiyonu ile Drosophila melanogaster embriyonik MSS nöronları etiketlemek nasıl açıklar. Bu yöntem çok detaylı nöronal hücre morfolojisi görselleştirme sağlar. Bu CNS herhangi bir hücreyi etiketlemek mümkündür: Hedef nöronların hücre gövdeleri DIC optik altında veya GFP gibi bir floresan genetik marker ekspresyonu ile görüntülenmiştir. Etiketleme sonra, Dii iletilen ışık ve DIC optik ile hücre morfolojisi görselleştirme izin photoconversion tarafından kalıcı kahverengi leke dönüşebilir. Alternatif olarak, DII-işaretli hücrelerin genetik olarak ortaya flüoresan raportör proteinlerin colocalised alınabilecek şekilde, konfokal mikroskopi ile doğrudan izlenebilir. Bu teknik, mümkün tek bir hücre çözünürlükte mutant fenotipleri analiz etmek için yapım genotip bağımsız olarak, herhangi bir hayvan da kullanılabilir.
Introduction
Bireysel hücrelerin düzeyde nöronal morfolojinin Bilgi nöronal bağlantı ve MSS fonksiyonu anlamak için önemli bir önkoşuldur. Böylece, nörobilim ilk günlerinden itibaren, araştırmacılar tek bir hücre etiketleme teknikleri (bu konuda tarihsel bir tedavi için 7) geliştirmeye çalışmışlardır. Böyle Golgi boyama gibi klasik yöntemler nöronal morfolojinin mükemmel çözünürlük sağlayan ama bir boyama rastgele bir şekilde oluşur gibi, yönlendirilmiş bir şekilde nöron belli bir tip etikete istiyorsa uygun değildir. Bir mikroelektrot boyaların ya da hücre içi juxtacellular enjeksiyon ile tek bir hücre boyama için yöntemlerin geliştirilmesi spesifik etiketleme ihtiyacı ele.
Drosophila tek nöron boya enjeksiyon uygulaması nedeniyle organizma ve nöronlar hem küçük boyutu, büyük bir meydan okumaydı. Embriyonik Drosophila Bununla birlikte, tek bir nöron boyama </em> Nöronlar Corey Goodman 15 laboratuarda 1980'lerin sağlandı. Yöntemi son derece yararlı olmuştur ve son 20-30 yıl içinde (örneğin 2, 10) üzerinde Drosophila nöronal gelişim için mekanizmalar içine bazı temel anlayışlar sağladı da, birçok işçi büyük ölçüde nedeniyle teknik talepleri, bu uzak shied var.
Drosophila nöronal etiketleme için genetik tekniklerin daha son yıllarda durumu da nöronun boya enjeksiyon şöhreti katkıda bulunmuştur. Membran hedefli GFP yapıları gal4 yönettiği ifade nöral morfolojisi 1, 20 mükemmel çözünürlük sağlayabilir. Ancak bu yöntem bazı sınırlamaları vardır: Birden hücrelerinde GFP sık kaçınılmaz ifadesi bireysel nöronların yapısı belirsiz olabilir ve bir gal4 sürücü line ilgi belirli bir nöron ifade sürücü mevcut olmayabilir. MARCM (Bir Tecrübe ile Mozaik Analiziressible Hücre Marker) yöntemi 8 tek hücre düzeyinde aslında herhangi nöronun etiketleme, ancak başarıyla çünkü GAL80 proteinin yavaş ciro embriyo ve erken larva olarak kullanılamaz sağlayabilir.
Genetik etiketleme bu sınırlamalar göz önüne alındığında, biz Drosophila embriyo o nöronun boya enjeksiyonu çok değerli bir yöntemdir kalır ve geniş uygulama hak inanıyorum. Bu hedefi desteklemek için, biz burada yöntemin ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Gücünü bir illüstrasyon geç Drosophila embriyo 14 abdominal neuromeres içinde internöron komple set morfolojisi bizim son hesabı tarafından sağlanmaktadır. Bireysel nöronal hücre tiplerinin morfolojik değişkenlik ve embriyonun MSS neuromere organizasyon ilkeleri hem ortaya bu çalışma, herhangi bir diğer mevcut etiketleme yöntemi ile mümkün olmazdı.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir model sistem olarak Drosophila'da bir büyük avantajı, tek hücreler seviyesinde gelişme ve işlev analizi olanak sağlamasıdır. Bu hücre türleri çeşitliliği son derece yüksek olduğunu ve komşu hücrelerin fonksiyon ve morfolojisi tamamen farklı olabilir sinir sistemi, ilgili özellikle yararlıdır.
Burada mevcut yöntem ya da kalıcı bir leke veya floresan mikroskobu ile doğrudan muayene dönüştürülmüştür edilebilir bir boya ile bireysel nöronların…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma DFG gelen GMT hibe tarafından desteklenen
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth | 4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.
Referências
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. From growth cone to synapse: the life history of the RP3 motor neuron. Dev. Suppl. , 227-238 (1993).
- Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures. J. Vis. Exp. (27), e1347 (2009).
- Grenningloh, G., Rehm, E. J., Goodman, C. S. Genetic analysis of growth cone guidance in Drosophila: fasciclin II functions as a neuronal recognition molecule. Cell. 67, 45-57 (1991).
- Kunz, T., Kraft, K. F., Technau, G. M., Urbach, R. Origin of Drosophila mushroom body neuroblasts and generation of divergent embryonic lineages. Development. 139, 2510-2522 (2012).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22, 451-461 (1999).
- Levick, W. R. Another tungsten microelectrode. Med. Biol. Eng. 10, 510-515 (1972).
- Matthes, D. J., Sink, H., Kolodkin, A. L., Goodman, C. S. Semaphorin II can function as a selective inhibitor of specific synaptic arborizations. Cell. 81, 631-639 (1995).
- Murray, M. J., Whitington, P. M. Effects of roundabout on growth cone dynamics, filopodial length, and growth cone morphology at the midline and throughout the neuropile. Journal of Neuroscience. 19, 7901-7912 (1999).
- Murray, M. J., Merritt, D. J., Brand, A. H., Whitington, P. M. In vivo dynamics of axon pathfinding in the Drosophilia CNS: a time-lapse study of an identified motorneuron. J. Neurobiol. 37, 607-621 (1998).
- Patel, N. H. Imaging neuronal subsets and other cell types in whole-mount Drosophila embryos and larvae using antibody probes. Methods Cell Biol. 44, 445-487 (1994).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P. M., Technau, G. M. Morphological characterization of the entire interneuron population reveals principles of neuromere organization in the ventral nerve cord of Drosophila. Journal of Neuroscience. 31, 15870-15883 (2011).
- Thomas, J. B., Bastiani, M. J., Bate, M., Goodman, C. S. From grasshopper to Drosophila: a common plan for neuronal development. Nature. 310, 203-207 (1984).
- Whitington, P., Harris, K. Early axonogenesis in the embryo of a primitive insect, the silverfish Ctenolepisma longicaudata. Development Genes and Evolution. 205 (5-6), 272-281 (1996).
- Whitington, P., Meier, T. Segmentation, neurogenesis and formation of early axonal pathways in the centipede, Ethmostigmus rubripes (Brandt). Development Genes and Evolution. 199, 349-363 (1991).
- Whitington, P. M., Seifert, E. Axon growth from limb motorneurons in the locust embryo: the effect of target limb removal on the pattern of axon branching in the periphery. Biologia do Desenvolvimento. 106, 438-449 (1984).
- Whitington, P. M., Leach, D., Sandeman, R. Evolutionary change in neural development within the arthropods: axonogenesis in the embryos of two crustaceans. Development. 118, 449-461 (1993).
- Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).
