זיהוי<em> יפהפה נרדם</em> הוספות Transposon בגידולים מוצקים באמצעות PCR לינקר בתיווך
Summary
שיטה של זיהוי נהגים לא ידועים של היווצרות הסרטן באמצעות גישה משוחדת מתוארת. השיטה משתמשת<em> יפהפה נרדם</em> Transposon כmutagen אקראי המכוונת לרקמות ספציפיות. מיפוי הגנום של הוספות transposon המניעות את היווצרות גידול מזהה אונקוגנים רומן וגני מדכאי סרטן
Abstract
ניתוח גנומי, proteomic, transcriptomic, וepigenomic של גידולים אנושיים מצביע על כך שיש אלף חריגות בתוך כל הגנום סרטן בהשוואה לרקמות מתאימות. בהתבסס על ניתוחים אלו ניתן לראות כי יש הרבה נהגים גנטיים ידועים של הסרטן 1. למרבה צער הנהגים האלה חבויים בתוך מספר גדול בהרבה של אנומליות נוסע בגנום שלא תורם באופן ישיר להיווצרות גידול. היבט נוסף של הגנום של הסרטן הוא שקיימת הטרוגניות גנטית ניכרה בתוך סוגי גידולים דומים. כל גידול יכול נמל מוטציות שונות המעניקות יתרון סלקטיבי להיווצרות גידול 2. ביצוע מסך גנטי קדימה משוחד בעכברים מספק את הכלים ליצירת גידולים ולנתח ההרכב הגנטי שלהם, תוך הפחתת רקע המוטציות נוסעות. היפיפייה נרדמת המערכת (SB) transposon היא שיטה אחת כזאת 3. המערכת מנצלת SB הנייד vectors (transposons) שניתן להוסיף לאורך הגנום על ידי אנזים transposase. מוטציות מוגבלות לסוג תא מסוים באמצעות שימוש באלל transposase המותנה שמופעל על ידי Cre recombinase. קווי עכבר רבים קיימים שrecombinase המפורש Cre ברקמות ספציפיות. על ידי חצייה אחד מהקווים הללו לאלל transposase המותנה (למשל קס-stop-קס-SB11), מערכת SB מופעלת רק בתאים שמבטאים Cre recombinase. Cre recombinase יהיה בלו קלטת תחנה שחוסמת ביטוי של אלל transposase, הפעלת mutagenesis transposon בתוך סוג התא המיועד לכך. מסך SB הוא שיזם רביית שלושה זנים של עכברים מהונדסים כך שעכברי הניסוי לשאת אלל מותנה transposase, concatamer של transposons, ואלל recombinase Cre רקמות ספציפיות. עכברים אלה אפשרו לגיל ועד צורת גידולים והם הופכים גוססים. העכברים הם אזהדנ"א הגנומי necropsied ומבודד מהגידולים. בשלב הבא, הדנ"א הגנומי נתונת המקשר בתיווך-PCR (LM-PCR) כי תוצאות בהגברה של לוקוסים הגנומי המכילים SB transposon. LM-PCR בוצע על גידול חד יגרום למאה amplicons השונה המייצג את מאה לוקוסים הגנומי המכילים הוספות transposon ב4 גידול יחידים. הוספות transposon בכל הגידולים מנותחות ואתרי החדרה נפוצים (CISS) מזוהים באמצעות שיטה סטטיסטית מתאימה 5. הגנים בתוך חבר העמים הם סבירים מאוד להיות אונקוגנים או גני מדכאי סרטן, והם נחשבים לגנים סרטניים מועמד. היתרונות של שימוש במערכת SB לזיהוי גנים סרטניים מועמדים הם: 1) transposon יכול בקלות להיות ממוקם בגנום בגלל הרצף שלו ידוע, 2) טרנספוזיציה יכולה להיות מופנה לכמעט כל סוג תא ו3) transposon מסוגל מציג גם רווח והפסד מוטציות-of-פונקצית 6. Following הפרוטוקול מתאר כיצד לתכנן ולהוציא לפועל מסך קדימה גנטי באמצעות מערכת transposon SB לזיהוי גנים סרטניים מועמד (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
מסך קדימה גנטי באמצעות המערכה היפיפייה הנרדמת transposon מספק שיטה לזיהוי מוטציות הגורמת לסרטן. על ידי בחירת האמרגן המתאים לשלוט Cre recombinase בנוסף לכל מוטציות predisposing, מסך SB יזהה ידוע וגנים סרטניים מועמד חדש.
ההצלחה של מסך SB היא …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לMoriarity Branden, הדוד Largaespada, ווינסנט Keng באוניברסיטת מינסוטה, והאדם Dupuy באוניברסיטה איווה על סיועם בפיתוח הפרוטוקול שתואר לעיל.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
Referências
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
