Identifikation af<em> Tornerose</em> Transposon Insertioner i solide tumorer med Linker-medieret PCR
Summary
En fremgangsmåde til identifikation af ukendte førere af carcinogenese under anvendelse af en objektiv metode er beskrevet. Fremgangsmåden anvender<em> Tornerose</em> Transposon som en tilfældig mutagen rettet mod specifikke væv. Genomisk kortlægning af transposon-insertioner, der driver tumordannelse identificerer hidtil ukendte onkogener og tumorsuppressorgener
Abstract
Genomiske, proteom, transkriptomisk, og epigenomic analyser af humane tumorer tyder på, at der er tusindvis af anomalier inden for hver kræft genom sammenlignet med matchede normalt væv. Baseret på disse analyser er det klart, at der er mange uopdagede genetiske førere af kræft 1. Desværre er disse chauffører er skjult i et langt større antal passagerer anomalier i genomet, som ikke bidrager direkte til tumordannelse. Et andet aspekt af kræft genomet er, at der er betydelig genetisk heterogenitet inden lignende tumortyper. Hver tumor kan harbor forskellige mutationer, der giver en selektiv fordel for tumordannelse 2. Udførelse af en uvildig fremad genetisk skærm i mus giver værktøjer til at generere tumorer og analysere deres genetiske sammensætning og samtidig reducere baggrund af passager mutationer. The Sleeping Beauty (SB) transposon-systemet er en sådan metode 3. SB system anvender mobile vectors (transposoner), der kan indsættes i hele genomet af transposasen enzym. Mutationer er begrænset til en specifik celletype ved anvendelse af en betinget transposase allel, der aktiveres af Cre-rekombinase. Mange muselinjer findes der udtrykker Cre-rekombinase i specifikke væv. Ved at krydse en af disse linjer til den betingede transposase allel (f.eks Lox-stop-Lox-SB11), er SB-systemet aktiveres kun i celler, som udtrykker Cre rekombinase. The Cre-rekombinase vil fjerner et stop-kassette, der blokerer ekspression af transposasen allel, derved aktivere transposon-mutagenese i det angivne celletype. En SB skærmen initieres ved avl tre stammer af transgene mus, således at de eksperimentelle mus bærer en betinget transposase allel, en concatamer af transposoner, og en vævsspecifik Cre-rekombinase allel. Disse mus får lov at ældes, indtil tumorer form og de bliver døende. Musene er dernæstobduceret og genomisk DNA isoleret fra tumorer. Dernæst genomiske DNA underkastet linker-medieret-PCR (LM-PCR), der resulterer i amplifikation af genomiske loci, der indeholder en SB transposon. LM-PCR udføres på en enkelt tumor vil resultere i hundredvis af forskellige amplikoner der repræsenterer hundrede genomiske loci, der indeholder transposon-insertioner i en enkelt tumor 4. Transposonet indrykninger i alle tumorer analyseres og fælles indsættelse sites (CISS) er identificeret ved hjælp af en passende statistisk metode 5. Gener i CIS er meget sandsynligt, at onkogener eller tumorsuppressorgener, og betragtes kandidat kræftgener. Fordelene ved at anvende SB system til at identificere kandidat-cancer-gener er: 1) transposonet kan let findes i genomet, fordi dets sekvens er kendt, 2) omsætning kan rettes til næsten enhver celletype og 3) transposonet kan indførelse af såvel gain-og tab af funktion mutationer 6. The following protokol beskriver, hvordan at udtænke og udføre en fremadrettet genetisk skærmen ved hjælp af SB transposon system til at identificere kandidat kræft gener (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
En forreste genetisk skærmen ved hjælp af Tornerose transposon system giver en fremgangsmåde til identifikation af mutationer, der forårsager cancer. Ved at vælge passende promotor til at styre Cre-rekombinase ud over de prædisponerende mutationer vil SB skærmen identificerer kendte og hidtil ukendte kandidat kræftgener.
Succesen af en SB skærmen er meget afhængig af de mus udvalgt til at skabe skærmen. For transposon, anbefaler vi at bruge to forskellige m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Branden Moriarity, David Largaespada, og Vincent Keng ved University of Minnesota, og Adam Dupuy ved University of Iowa for deres assistance i udviklingen af protokollen beskrevet ovenfor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
Referências
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
