Generering af stabile humane cellelinjer med tetracyklin-inducerbare (Tet-on) shRNA eller cDNA Expression
Summary
En hurtig og enkel måde at generere humane cellelinier med inducerbare og reversibel cDNA overekspression eller shRNA-medieret knock-down af genet af interesse. Denne metode gør det muligt for forskerne at pålideligt og meget reproducerbart manipulere cellelinier, som er vanskeligt at ændre ved transient transfektion metoder eller konventionelle knockdown / knockout strategier.
Abstract
En vigtig metode inden for pattedyrcelle biologi er manipulering af ekspressionen af gener af interesse i udvalgte cellelinier, med henblik på at afsløre en eller flere af genets funktion (er) under anvendelse af overspændinger / stabil overekspression eller knockdown af genet af interesse. Desværre for forskellige celle-biologiske undersøgelser denne fremgangsmåde er uegnet, når manipulationer af genekspression resulterer i cellevækst / proliferation defekter eller uønsket celledifferentiering. Derfor har forskere tilpasset tetracyclin repressorproteinet (Tetr), taget fra E. coli tetracyclinresistens-operonet 1, til at generere meget effektive og stramme regulerende systemer til at udtrykke cDNA'er i pattedyrceller 2,3. Kort sagt har Tetr blevet modificeret til enten (1) blok initiering af transkription ved binding til den Tet-operatoren (TO) i promotorregionen ved tilsætning af tetracyclin (betegnet Tet-off system) eller (2) binder til i tHan fravær af tetracyclin (betegnet Tet-on system) (fig. 1). I betragtning af den ulempe, at Tet-off system kræver en konstant tilstedeværelse af tetracyclin (som har en halveringstid på omkring 24 timer i væv celledyrkningsmedium) Tet-on er blevet mere ekstensivt optimeret, hvilket resulterer i udvikling af meget stramme og effektive vektorsystemer til cDNA-ekspression som anvendt her.
Kort efter indførelse af RNA-interferens (RNAi) for genet knockdown i pattedyrceller 4, vektorer, der udtrykker short-hairpin RNA (shRNAs) blev beskrevet som fungerer meget lig siRNAs 5-11. Disse shRNA-medierede knockdown metoder har den samme begrænsning som konventionelle knockout strategier, idet stabil depletering ikke er muligt, når genmål er afgørende for cellulær overlevelse. For at overvinde denne begrænsning, van de Wetering et al. 12 modificeret shRNA ekspressionsvektoren pSUPER 5 </sup> ved at indsætte en AT i promotorregionen, hvilket gjorde dem i stand til at generere stabile cellelinjer med tetracyklin-inducerbare udtømning af deres target-gener af interesse.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til effektivt at generere stabile human Tet-på cellelinjer, som pålideligt driver enten inducerbar overekspression eller nedbrydning af genet af interesse. Med denne metode har vi med succes skabt Tet-on cellelinier, som væsentligt lettede analyse af MST / hMOB / NDR kaskade i centrosome 13,14 og apoptose signalering 15,16. I denne rapport beskriver vi vore vektorer af valg, ud over at beskrive de to på hinanden følgende manipulation trin, der er nødvendige for effektivt at generere human Tet-on cellelinier (figur 2). Desuden foruden skitserer en protokol til generering af humane Tet-on cellelinjer, vil vi diskutere kritiske aspekter vedrørende de tekniske procedurer og karakterisering af Tet-on celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi mener, at Tet-on systemer i høj grad lette analyse af genfunktion, især i cellesystemer, der er vanskelige at manipulere og / eller når den manipulerede gen er væsentlig for celleoverlevelse. Endvidere evnen til at kontrollere genekspression ved meget specifikke Tet-on systemer giver mulighed for at studere genfunktioner på forskellige stadier (f.eks under cellecyklusprogression eller veldefinerede differentieringsprocesser). Den metode præsenteres her, vil gøre det muligt for forskerne at generere den ønsked…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmer af vores laboratorium for personer diskussioner. Vi takker Joanna Lisztwan og Christina Gewinner for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af BBSRC tilskud BB/I021248/1 og Wellcome Trust tilskud 090090/Z/09/ZAH er et Wellcome Trust Research Career Development stipendiat ved UCL Cancer Institute.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
Referências
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
