דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.
גישה מרכזית בתחום הביולוגיה של תא יונקת היא המניפולציה של הביטוי של גנים של עניין שורות תאים נבחרות, במטרה לחשוף את אחד או כמה מתפקודו של הגן (ות) באמצעות ביטוי יתר או מציאה חולף / יציב של הגן של עניין. למרבה הצער, לחקירות ביולוגיות תאים שונות גישה זו אינה מתאימה כאשר תוצאת מניפולציות של ביטוי גנים בתאי פגמי צמיחה / שגשוג או התמיינות תאים לא רצויה. לכן, חוקרים התאימו את החלבון המדכא טטרציקלין (TetR), נלקח מE. coli התנגדות טטרציקלין 1 אופרון, לייצר מערכות ויסות יעילות מאוד וחזקות להביע cDNAs בתאי יונקי 2,3. בקיצור, TetR שונתה כדי או (1) ייזום בלוק של שעתוק באמצעות קשירה למפעיל ט (TO) באזור המקדם על תוספת של טטרציקלין (שמכונה מערכה ט הכבוי) או (2) לאגד ל לאהוא היעדר טטרציקלין (מכונה ט במערכת) (איור 1). בהתחשב באי הנוחות שהמערכה ט הפעמי דורשת נוכחות הרציפה של טטרציקלין (שבו יש זמן מחצית חיים של כ 24 שעות במדיום תרבית תאי רקמה) ט במערכת כבר מותאם באופן נרחב יותר, וכתוצאה מכך להתפתחות מאוד הדוק ומערכות וקטור יעילות לביטוי cDNA משמשות כאן.
זמן קצר לאחר הקמתה של התערבות RNA (RNAi) למציאת גנים בתאי יונקים 4, וקטורים המבטאים RNAs-מכבנה קצרה (shRNAs) תוארה שפונקציה דומה מאוד לsiRNAs 5-11. עם זאת, גישות מציאת shRNA בתיווך אלה יש להם מגבלה כאסטרטגיות נוקאאוט קונבנציונליות, שכן דלדול יציב הוא לא ריאלי כאשר מטרות גנים הן חיוניות להישרדות תאים. כדי להתגבר על מגבלה זו, ואן דה Wetering et al. שונים 12 shRNA ביטוי וקטור pSUPER 5 </su> P על ידי החדרה לאזור האמרגן, שאפשר להם להפיק שורות תאי יציבות עם דלדול טטרציקלין-מושרה של גני מטרת עניין שלהם.
כאן, אנו מתארים שיטה יעילה להפקה יציבה אדם ט בשורות תאים שיניעו מהימן או ביטוי יתר מושרה או דלדול של הגן של עניין. באמצעות שיטה זו, יש לנו נוצרו בהצלחה ט בשורות תאים אשר הקלו באופן משמעותי על הניתוח של MST / hMOB / NDR המפל בcentrosome 13,14 ואפופטוזיס איתות 15,16. בדו"ח זה, אנו מתארים הווקטורים של בחירה שלנו, בנוסף לתיאור שני שלבי המניפולציה הרצופים הנדרשים ביעילות כדי ליצור אדם ט בשורות תאים (איור 2). יתר על כן, מלבד מתאר פרוטוקול עבור הדור של אדם ט בשורות תאים, נדונו היבטים קריטיים לגבי הנהלים הטכניים והאפיון של ט בתאים.
אנו מאמינים כי ט במערכות להקל על הניתוח של תפקוד הגן באופן משמעותי, במיוחד במערכות תא שקשה לתמרן ו / או כאשר גן המניפולציות הוא חיוני להישרדות תא. יתר על כן, היכולת לשלוט על ביטוי גנים על ידי ט במערכות מאוד ספציפיות מציעה את ההזדמנות ללמוד פונקציות גנטיות בשלבים שונים (…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לכל החברים במעבדה שלנו לדיונים מועילים. אנו מודים ג'ואנה Lisztwan וכריסטינה Gewinner לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק BBSRC BB/I021248/1 וקרן Wellcome מענק 090090/Z/09/ZAH היא עמית קרן Wellcome מחקר פיתוח קריירה בUCL מכון הסרטן.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |