Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi
Summary
Indüklenebilir ve ilgilenilen genin reversibl cDNA aşırı veya shRNA aracılı knock-down ile insan hücre hatları oluşturmak için bir hızlı ve kolay yolu. Bu yöntem geçici transfeksiyon yöntemleri veya konvansiyonel knockdown / nakavtla stratejileri değiştirmek zordur güvenilir ve son derece tekrarlanabilir işlemek hücre hatları için araştırmacılar sağlar.
Abstract
Memeli hücre biyolojisi alanında önemli bir yaklaşımı gösterir etmek amacı ile, seçilen hücre hatları ilgi genlerinin ifadesi manipülasyon bir ya da bu genin geçici / kararlı ekspresyonu ya da devirme kullanılarak gen fonksiyonu (ler) in çeşitli ilgi. Ne yazık ki, çeşitli hücre biyolojik araştırmalar için bu yaklaşımın uygun olduğunda hücre büyümesi / çoğalması kusurları veya istenmeyen hücre farklılaşmasında gen ekspresyonu sonucu manipülasyonlar. Bu nedenle, araştırmacılar E. alınan Tetrasiklin repressör proteini (Tetr), adapte olması coli, tetrasiklin direnci operon 1, 2,3, memeli hücrelerinde cDNA ifade etmek için çok verimli ve sıkı düzenleyici sistemleri üretmek için. Kısacası, Tetr de TO tetrasiklin (Tet-off sistemi olarak adlandırılır) ilavesinden sonra yükseltici bölgesinde Tet-operatör (TO) bağlanarak veya (2) bağlama ile transkripsiyon (1) blok başlatma ya da için modifiye edilmiştir ttetrasiklin onun yokluğunda (sistem Tet-on adlandırılır) (Şekil 1). Tet-off sistemi tetrasiklin sürekli varlığı (hangi doku hücre kültürü ortamında yaklaşık 24 saat bir yarılanma ömrüne sahiptir) gerektirir rahatsızlık Verilen Tet-sistem daha kapsamlı çok sıkı geliştirme sonuçlanan optimize edilmiştir ve cDNA ifade vektörü için etkili sistemler burada kullanılan şekliyle.
Yakında kısa saç tokası RNA'lar (shRNAs) eksprese 4 memeli hücrelerinde, vektörler gen demonte için RNA interferans (RNAi) kurulması sonrası siRNA'lar 5-11 çok benzer işlevi tanımlanmıştır. Gen hedefleri hücresel hayatta kalmak için gerekli olan zaman stabil tükenmesi mümkün değildir Bununla beraber, bu shRNA aracılı knockdown yaklaşımları, konvansiyonel nakavt stratejiler aynı sınırlama var. Bu sınırlandırmayı aşmak için, van de Wetering ark. 12. shRNA ekspresyon vektörü pSUPER modifiye 5 </suOnları kendi ilgi hedef genlerin tetrasiklin indüklenebilir tükenmesi ile stabil hücre hatları oluşturmak için etkin promotor bölgede TO ekleyerek p>.
Burada, biz verimli üretmek için bir yöntem tarif istikrarlı insan Tet-on güvenilir indüklenebilir aşırı veya ilgi gen tükenmesi ya götürmek hücre hatları. Bu yöntemi kullanarak, başarılı yarattı Tet-önemli ölçüde sentrozom 13,14 ve 15,16 sinyalizasyon apoptoz MST / hMOB / NDR çağlayan analizi kolaylaştırdı hücre hatları. Bu yazıda, tercih edilen bizim vektörleri tarif verimli üretilmesi için gerekli olan iki ardışık işleme adımları tanımlayan ek olarak insan Tet-on hücre hatları (Şekil 2). Dahası, nesil için bir protokol taslağını yanısıra insan Tet-on hücre hatları, biz kritik teknik prosedürleri ile ilgili yönlerini ve karakterizasyonu hücreleri Tet-üzerinde görüşecek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz, Tet-on sistemi büyük ölçüde özellikle manipüle gen hücrenin hayatta kalması için gerekli olan zaman idare ve / veya zor olan hücre sistemleri, gen fonksiyonu analizini kolaylaştırmak inanıyoruz. Ayrıca, son derece spesifik Tet-on sistemi ile gen ekspresyonu kontrol etme yeteneği farklı aşamalarında (hücre siklus progresyonu veya iyi tanımlanmış farklılaşma süreçleri sırasında örneğin) genlerin fonksiyonlarının çalışma fırsatı sunuyor. Burada sunulan yöntem araştırmacılar ol…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz yararlı tartışmalar için laboratuarımızda tüm üyelerine teşekkür ederim. Biz yazının eleştirel okuma Joanna Lisztwan ve Christina Gewinner ederim. Bu çalışma BBSRC hibe BB/I021248/1 tarafından desteklenen ve Wellcome Trust hibe 090090/Z/09/ZAH UCL Kanser Enstitüsü'nde Wellcome Trust Araştırma Kariyer Geliştirme akademisyendir edildi.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Invitrogen | 16000-044 | Tested Tet-free |
| Blasticidin | Invivogen | ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invivogen | ant-zn-5 | |
| G418 | PAA laboratories | P31-011 | 100 mg/ml in media |
| anti-TET02 | MoBiTec GmbH | TET02 | Use at 1/1000 to 1/2000 for WB |
| pcDNA6/TR | Invitrogen | V1025-20 | |
| pT-Rex DEST30 | Invitrogen | 12301-016 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128 | 2 mg/ml in ethanol |
| Doxycycline | Sigma | D9891 | 2 mg/ml in water |
| Cloning cylinders | Bellco Glass Inc. | 2090-00808 | re-useable |
Referências
- Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
- Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
- McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
- Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3′ overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
- Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
- Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
- Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
- Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
- van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
- Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
- Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
- Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
- Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
- Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).
