Den nuværende protokol giver en detaljeret trin-for-trin beskrivelse af de procedurer, der er nødvendige for at udføre målinger af åndedrætsorganerne mekanik samt vurdering af luftvejs lydhørhed over for inhaleret methacholin hos mus ved hjælp af tvungen svingning teknik (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Qc , Canada).
Den tvungne svingning teknik (FOT) er en kraftfuld, integrativ og translationel værktøj tillader den eksperimentelle vurdering af lungefunktionen hos mus i en omfattende, detaljeret, præcis og reproducerbar måde. Det giver målinger af åndedrætsorganerne mekanik gennem en analyse af tryk og volumen signaler erhvervet i reaktion på foruddefinerede, lille amplitude, oscillerende luftstrøm kurveformer, der typisk anvendes på emnet luftveje åbning. Denne protokol beskriver de nødvendige skridt til at tilstrækkeligt udføre tvungen svingning målinger hos mus ved hjælp af en computerstyret stempel ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada). Beskrivelsen er opdelt i fire dele: indledende skridt mekanisk ventilation, lungefunktion målinger og dataanalyse. Det omfatter også oplysninger om, hvordan man vurderer luftvejsreaktivitet for inhaleret methacholin i bedøvede mus, en fælles anvendelse af dette technique, der også omfatter andre resultater og forskellige lunge patologier. Målinger opnået i naive mus samt fra en oxidativ stress drevet model af luftvejs skader præsenteres for at illustrere, hvordan dette værktøj kan bidrage til en bedre karakterisering og forståelse af de undersøgte fysiologiske ændringer eller sygdomsmodeller samt applikationer i nye forskningsområder.
Fyldestgørende karakterisering af de mekaniske egenskaber af lungerne i små dyr er blevet afgørende, da den spirende af murine modeller i luftvejene videnskab. Når den udføres efter tvungen svingning teknik (FOT), en teknik anvendes også i mennesker, disse målinger giver en kraftfuld, integrativ og translationel tilgang til at studere meningsfulde fysiologiske ændringer. FOT målinger opnås typisk ved at analysere tryk og volumen signaler erhvervet som reaktion på en foruddefineret, lille amplitude, oscillerende luftstrøm bølgeform (også kaldet forstyrrelse eller indgangssignal) anvendes på individets luftveje åbning 1.. I sin enkleste form, ville en FOT perturbation være en enkelt sinusformet bølgeform på en veldefineret frekvens. Mere komplekse perturbationer består typisk af en superposition af et udvalg af specifik (gensidigt prime) frekvens kurver, der dækker et bredt spektrum. Nedbrydningen af multi-frekvensinput og output signaler til deres vælgere ved hjælp af Fouriertransformation giver mulighed for beregning af åndedrætssystemet indgangsimpedans (ZRS), dvs overførsel funktion mellem input og output signaler, ved hver frekvens inkluderet i perturbation 2.. Derfor FOT tillader samtidig vurdering af respiratoriske mekanik over et område af frekvenser i en enkelt manøvre 2.. Montering af avancerede matematiske modeller (f.eks Constant Phase Model 3) til de impedansdata derefter tillade, at en opdeling af respons i luftvejene (centrale og perifere), og parenkym lungevæv afhængige parametre 1, 3. Fordi mange faktorer fysiologiske respons (fx vejrtrækning frekvens, tidalvolumen, lungevolumen, øvre luftveje, spontane vejrtrækning indsats, tidspunkt for målinger) kontrolleres og standardiseret af målesystemet og eksperimentelle procedurer, 1. teknikken er capstand til at generere præcise og reproducerbare målinger, forudsat at den udføres korrekt. Formålet med denne artikel er at give en detaljeret, kronologisk beskrivelse af proceduren er nødvendig for at udføre sådanne målinger i mus. Protokollen består af fire dele: forberedende trin (reagenser, udstyr og fag), mekanisk ventilation, lungefunktion målinger og dataanalyse. Eksempler på repræsentative resultater af åndedrætsorganerne mekanikere genereres ved hjælp af en computer-styret stempel ventilator (flexiVent, SCIREQ Inc, Montreal, Qc, Canada) er forudsat. Disse blev opnået fra naive mus samt fra en oxidativ stress drevet model af luftvejs skader karakteriseret ved luftvejsinflammation, epitelcelle skader og øget luftvejsreaktivitet til inhaleret aerosoliseret methacholin 4.. Mens dette protokol bruges ofte til at vurdere luftvejsreaktivitet overfor inhaleret methacholine det breder sig til andre resultater og various patologier, herunder astma, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL), emfysem, lungefibrose, lunge skade samt transgene musemodeller for patologier svarende til human sygdom. Forskningsresultater hjælp af dette værktøj kan bidrage til en bedre karakterisering og forståelse af fysiologiske ændringer eller sygdomsmodeller samt ekspansion på nye forskningsområder.
Den fortsatte undersøgelse af luftvejene dysfunktion som det vedrører astma og andre lungesygdomme er altoverskyggende for forståelsen af de underliggende mekanismer af sygdommen og udvikling af behandlingsmuligheder. Brugen af mus model luftvejssygdom har været afgørende i at få forståelse ind i disse sygdomsmekanismer. Når man overvejer evaluere luftveje dysfunktion i et emne så lille som en mus, der har pålidelige og nøjagtige værktøjer til måling af lungefunktionen er kritisk. Desuden har værktøjer kan levere indsigt på placeringen af luftvejene dysfunktion eller terapeutisk effekt er uvurderlig. Den FOT teknik kombinerer alle disse egenskaber og giver en kraftfuld, integrativ og translationel tilgang til at evaluere fysiologiske ændringer.
For at få succes med denne type måling i mus, bør man være særlig opmærksom på et par skridt, nemlig kalibrering af systemet, modstanden i endotrakeale cannula, typen af forstøveren (såvel som dets drift indstillinger) positionering af dyret og standardisering af lungevolumen historie. Desuden er det bydende nødvendigt for at opnå gyldige datasæt fagets åndedrætsorganerne forbliver passiv under målingerne. Dette kan opnås ved indgivelse af en muskel lammende agent, der arbejder på et dybt plan af anæstesi eller ved hyperventilating emnet at inducere apnø (se tabel 1). Efterforskere kan starte ved at mestre systemet og dets operativsystem software, hvis det ønskes, med prøvebelastninger, mens erhverve de nødvendige færdigheder for målinger i mus. Det ville da være logisk at generere reproducerbare resultater i naive dyr før du flytter til sygdomsmodeller eller behandlede mus. Da en vigtig del af sygdomsmodeller i luftvejene forskning indebærer udsætter dyrene stoffer såsom allergener, toksiner, forurenende stoffer, cigaretrøg eller gasser, foranderlighed i de opnåede resultater med measurement teknik beskrevet i denne artikel kan derfor blive påvirket af eksponeringen anvendte procedure. Standardisering af centrale eksperimentelle processer (fx anvendelse af computer-kontrollerede eksponering og målesystemer 6, 13, 14) kan potentielt have en betydelig indvirkning på at reducere variabilitet.
Eksemplerne i denne artikel repræsenterer et udvalg af typiske resultater fra naive og klor-eksponerede mus eksperimenter samtidig fremhæver de stærke samt begrænsninger i teknik. Som det kan ses for eksempel i figur 6, at teknikken er i stand til at generere reproducerbare lungefunktionsmålinger. Mens lignende baseline modstandsværdier blev rapporteret mellem musestammer blev forskelle i elastans dog observeret 15. Væsentlige ændringer er også forventes mellem spædbarn og voksne mus 16. Som for andre in vivo fysiologiske vurdering høj præcision resultater, såsom those genereret af FOT, kommer med en indrømmelse med hensyn til den naturlige tilstand af fagene. Dette princip, der er benævnt fænotypebestemmelse ubestemthedsprincippet 1, finder anvendelse i nærværende protokol i den forstand, at målingerne skal foretages i bedøvede, tracheotomised (eller mundtligt intuberet) og mekanisk ventilerede patienter. En anden begrænsning af teknikken observeres i figur 5D-5F, hvor data ikke er tilgængelige ved de højeste koncentrationer for klor-eksponerede gruppe, fordi tilpasningen af Constant Phase Model til data er dårlig over moderate niveauer af bronkokonstriktion. Imidlertid kunne alvorligt bronchoconstricted dyr vurderes ved at analysere ZRS direkte 15, eller ved at bruge tredjeparts post-analyse software til at passe mere komplekse matematiske modeller, fx under hensyntagen til uensartethed mekaniske funktion 17.. Udelukkede datasæt kan også observeres, hvis dyrets luftveje ikke er tilstrækkeligt passive eller hvis modstanden af kanylen er for høj. Som en tommelfingerregel bør modstanden af kanylen ikke overstige dyrets modstand ved baseline. Arbejde med en kanyle af større indre diameter, og / eller kortere længde vil hjælpe med at reducere kanylen modstand. Endelig kan den nuværende demonstration af FOT målinger i mus blive opfattet som en tidskrævende og derfor mindre effektive metode eller mindre gældende for longitudinelle studier sammenlignet med mindre invasive teknikker. Men de sidstnævnte er forbundet med en stor usikkerhed med hensyn til grundlaget for deres udfald og er set af mange som værende fejlbehæftet 1.. Gentagne invasive målinger er mulige i oralt intuberede dyr, selv om de teknisk mere udfordrende 17.
Fra de givne eksempler, viste resultater ligestilling af de to generationer af flexiVent systemet at producere målinger af respiratoriske mekanik, samt luftvejs hyperreactivitet og overfølsomhed over for inhaleret methacholin efter klor-eksponering i mus. Når det bruges til at karakterisere eller forstå fysiologiske ændringer eller sygdom modeller, detaljeret måling aspekt relateret til teknikken kan bidrage til at forlænge den nuværende viden.
The authors have nothing to disclose.
TKMcG understøttes af en studentship fra den canadiske Thoracic Society.
Forfatternes BIDRAG
Alle forfattere deltog i udformningen af manuskriptet. Desuden indledte TKMcG projektet indsamlede eksperimentelle resultater, har bidraget til at skrive manuskriptet, og en kritisk undersøgelse. AR indsamlet og analyseret eksperimentelle resultater, udarbejdet manuskriptet og bidrog til en kritisk undersøgelse. LF indsamlede eksperimentelle resultater og bidrog til kritisk gennemgang af manuskriptet. TFS og JGM bidraget til kritisk gennemgang af manuskriptet.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
Acetyl-β-methylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A-2251 | Methacholine |
Micro-Adson forceps, serrated 12 cm | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Moria MC31 forceps, serrated-curved | Fine Science Tools | 11370-31 | |
Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm | Fine Science Tools | 14058-11 | |
Spring scissors-2.5 mm blades, straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Non-sterile blunt needle (18g x ½”) | Brico Medical Supplies Inc. | BN1805 | Endotracheal cannula |
Non-sterile 5-0 silk suture | Seraflex | IDI58000 | |
Phosphate buffered solution | Gibco | 14190-144 | |
15 ml conical tubes | Starstedt | SS-4001 | |
1 ml TB syringes | Becton Dickinson | 309626 | |
200 μl filter tips | Biosphere | 70.760.211 | |
EQUIPMENT | |||
flexiVent FX | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |
Aerogen Aeroneb nebulizer | SCIREQ Inc. | sales@scireq.com | www.scireq.com |