يوصف بروتوكول للتحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA) والإنتاجية العالية التدفق الخلوي لتقييم البوليمرية النانوية لتوصيل الجينات. ويستخدم لوصف NTA حجم الجسيمات جسيمات متناهية الصغر وتوزيع البلازميد توزيع الجسيمات في. الإنتاجية العالية التدفق الخلوي تمكن الكمي تقييم فعالية ترنسفكأيشن للمكتبة من المواد الحيوية لتوصيل الجينات.
وقد برزت غير الفيروسية توصيل الجينات باستخدام الجسيمات النانوية البوليمرية كنهج جاذبية للعلاج بالجينات لعلاج الأمراض الوراثية (1) وبوصفها تكنولوجيا للطب التجديدي 2. على عكس الفيروسات، والتي لها قضايا السلامة كبيرة، ويمكن تصميم النانوية البوليمرية أن تكون غير سامة، غير مناعة، غير مطفرة وأسهل لتجميع، وتنوعا كيميائيا، قادرة على حمل أكبر البضائع القابلة للتحلل الحمض النووي وو / أو استجابة للبيئة. البوليمرات الموجبة الشحنة السالبة مع DNA عن طريق التفاعل الكهربائي لتشكيل مجمعات بناء على أمر من 100 نانومتر التي تسمى عادة النانوية البوليمرية النفس التجمع. أمثلة على المواد الحيوية المستخدمة لتشكيل البنى النانوية لتوصيل الجينات polycationic تشمل متعدد الليزين، polyphosphoesters، وبولي (amidoamines) ق وpolyethylenimine (PEI)، وهو غير القابلة للتحلل قبالة الجاهزة للاستخدام البوليمر الموجبة تستخدم عادة لتسليم الحمض النووي 1،3. بولي (بيتا الأمينيةاستر) ق (PBAEs) هي أحدث فئة من البوليمرات الموجبة 4 أن للتفكك وهيدروليكيا 5،6 وقد ثبت أن تكون فعالة في إيصال الجينات إلى أنواع الخلايا التي يصعب بالنقل مثل خلايا الشبكية البطانية الإنسان (HRECs) 7، الماوس الخلايا الظهارية الثديية 8، خلايا سرطان الدماغ 9 و الأوعية الكبيرة (الإنسان الوريد السري، HUVECs) الخلايا البطانية 10.
ووصف بروتوكول جديد لتوصيف جزيئات البوليمر باستخدام تحليل جسيمات متناهية الصغر تتبع (NTA). في هذا النهج، ويتم الحصول على كل حجم الجسيمات توزيع وتوزيع عدد من الجسيمات في البلازميدات 11. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم الإنتاجية العالية ترنسفكأيشن 96-وحة جيدا الفحص للكشف السريع للفعالية ترنسفكأيشن من الجسيمات النانوية البوليمرية. وتستخدم في هذا البروتوكول، وتستخدم بولي (بيتا الأمينية استر) ق (PBAEs) والبوليمرات ونموذج الإنسان الخلايا البطانية الشبكية (HRECs) كما موديل الخلايا البشرية. يمكن هذا البروتوكول تكيف بسهولة مع أي جسيمات متناهية الصغر البوليمرية تقييم وأي نوع من الخلايا في المصالح في شكل لوحة متعددة أيضا.
تحديد عدد البلازميدات المعقد في جسيمات متناهية الصغر من المهم أن التصميم الفعال القائم على جسيمات متناهية الصغر لتوصيل الجينات الاستراتيجيات، وخاصة للتسليم المشترك من البلازميدات متعددة إلى نفس الخلية المستهدفة، كما هو مطلوب في كثير من الأحيان الخلايا الجذعية إعادة برمجة الدراسات 12. وقد وصفت بعض النهج لحساب عدد من البلازميدات المرتبطة جسيمات متناهية الصغر واحدة، ولكل النهج عيوب في التقنيات المستخدمة لتقدير 13-16. وقد استخدم الكم نقطة (QD) جنبا إلى جنب مع وضع العلامات TEM لتقدير البلازميدات في الجسيمات في الشيتوزان القائمة على الجسيمات النانوية. معقد تقدير مع هذه التقنية QD بسبب الحاجة لتسمية DNA، والتي قد تغير في خصائص التجميع الذاتي، واحتمال أن لا يتم الكشف عن الحمض النووي غير المسماة مغلفة مباشرة؛ البلازميدات يحتمل أن تكون متداخلة وQDs في الصور TEM 2D من الجسيمات، و الافتراضات الأخرى تبسيط 13. نهج بديل هو أنpplicable عندما microdomains أمر موجود في جزيئات وقد استخدمت لدراسة الحمض النووي المجمعات Lipopolyamine عبر المجهر الإلكتروني انتقال البرد (البرد TEM)، وتشتت الأشعة السينية، وديناميكية تشتت الضوء (DLS) 14،15. للأسف، مثل المواد النانوية البوليمرية التحقيق هنا لا تنطبق مع هذا الأسلوب. وفي دراسة أخرى، وتستخدم كولينز وآخرون تدفق الجسيمات صورة تقنية التحليل لدراسة (ليز) التي تحتوي على الببتيد 16 / DNA المجمعات، إلا أنه يمكن تقييم طريقتهم فقط أكبر، ميكرون الحجم الجسيمات 16. وهكذا، فإننا وضعت مؤخرا فحص الرواية ومرنة لتحديد عدد من جسيمات متناهية الصغر في البلازميدات 11.
البروتوكولات أعلاه تصف أساليب تقييم فعالية ترنسفكأيشن من الصيغ جسيمات متناهية الصغر، وكذلك وسيلة لتوصيف حجم الجسيمات والتحميل DNA من الجسيمات النانوية. عدد البلازميدات في الجسيمات هي العوامل الهامة التي يمكن أن تساعد في التنبؤ فعالية من الجسيمات ويمكن أن تستخدم أيض…
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) وNIH R21CA152473 حصول على الدعم.
Reagent | |||
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
Materials | |||
Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
NS500 | Nanosight | NA |