Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri
Summary
En protokol til nanopartikler sporing analyse (NTA) og højkapacitetsidentifikation flowcytometri for at evaluere polymere genafgivelsessystemer nanopartikler beskrives. NTA anvendes til at karakterisere nanopartikel partikelstørrelsesfordeling og plasmidet pr partikelfordeling. High-throughput flowcytometri muliggør kvantitativ transfektion Effektevalueringen for et bibliotek af gen-leveringsvehikler biomaterialer.
Abstract
Ikke-virale gen-levering ved anvendelse af polymere nanopartikler har vist sig som en attraktiv fremgangsmåde til genterapi til behandling af genetiske sygdomme 1 og som en teknologi til regenerativ medicin 2. Modsætning til vira, som har væsentlige sikkerhedsproblemer kan polymere nanopartikler være udformet til at være ikke-toksisk, ikke-immunogen, ikke-mutagene, lettere at syntetisere, kemisk alsidig, kan bære større nukleinsyre fragt og bionedbrydelige og / eller miljømæssigt responsiv. Kationiske polymerer selv samle med negativt ladet DNA via elektrostatisk interaktion til dannelse af komplekser af størrelsesordenen 100 nm, som normalt betegnes polymere nanopartikler. Eksempler på biomaterialer anvendes til dannelse nanoskala polykationiske genafgivelsessystemer nanopartikler indbefatter polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoaminer) s og polyethylenimin (PEI), som er en ikke-nedbrydelige off-the-shelf kationiske polymer almindeligvis anvendes til nukleinsyreadministrationskompleks 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) er en nyere klasse af kationiske polymerer 4, som er hydrolytisk nedbrydelig 5,6 og har vist sig at være effektive til genafgivelse til svære at transficere celletyper, såsom humane retinale endotelceller (HRECs) 7, muse mamma-epiteliale celler 8, menneskelige hjerne cancerceller 9 og makrovaskulære (human navlevene, HUVEC'er) endotelceller 10.
En ny protokol til at karakterisere polymere nanopartikler anvender nanopartikler tracking analyse (NTA) er beskrevet. I denne fremgangsmåde er både partikelstørrelsesfordelingen og fordelingen af antallet af plasmider pr partikel opnået 11. Endvidere er et high-throughput 96-brønds plade transfektionsassay til hurtig screening af transfektion effektiviteten af polymere nanopartikler præsenteret. I denne protokol, er poly (beta-amino ester) s (PBAEs) anvendes som model polymerer og humane retinale endotelceller (HRECs) anvendes som model humane celler. Denne protokol kan let tilpasses til at evaluere en polymer nanopartikel og enhver celletype af interesse i en multi-brønds pladeformat.
Introduction
Bestemmelse af antallet af plasmider kompleksbundet pr nanopartikel er vigtigt at udforme effektive nanopartikel-baserede genafgivelsessystemer strategier, navnlig til samtidig tilførsel af multiple plasmider i den samme celle målet, som det ofte er nødvendig stamcelle omprogrammering studier 12. Få metoder til at beregne antallet af plasmider, der er forbundet med en enkelt nanopartikel er blevet beskrevet, og hver metode har ulemper i de teknikker, der anvendes til estimering 13-16. Kvantepunktet (QD) mærkning kombineret med TEM er blevet anvendt til at estimere plasmider pr partikel i chitosan-baserede nanopartikler. Estimation med denne QD teknik er kompliceret på grund af behovet for at mærke DNA, hvilket kan ændre sine selvsamling egenskaber, muligheden for, at indkapslede umærket DNA ikke er umiddelbart detekteres; potentielt overlappende plasmider og QDs i 2D TEM-billeder af partikler, og andre forenklende antagelser 13. En alternativ fremgangsmåde, der er enpplicable når ordnet mikrodomæner findes i partiklerne er blevet anvendt til at undersøge lipopolyamin-DNA-komplekser via cryo-transmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM), røntgenspredning, og dynamisk lysspredning (DLS) 14,15. Desværre materialer, såsom de polymere nanopartikler undersøgt her ikke anvendelse med denne metode. I en anden undersøgelse anvendes Collins et al en strøm partikel billedanalyse teknik til at studere (Lys) 16-indeholdende peptid / DNA-komplekser. Kan imidlertid deres metode kun evaluerer større, mikrometerstore partikler 16. Således har vi for nylig udviklet en ny og fleksibel assay til at kvantificere antallet af plasmider pr nanopartikel 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollerne ovenfor beskriver fremgangsmåder til evaluering af transfektion effekten af nanopartikel formuleringer, såvel som en metode til karakterisering af partikelstørrelsen og DNA loading af nanopartiklerne. Antallet af plasmider pr partikel er en vigtig parameter, som kan hjælpe med at forudsige effektiviteten af partiklen og kan også anvendes til fastsættelse af dosis. Nanopartikel sporing analyse kan udføres i en række forskellige vandige opløsninger, såsom de afviger i saltkoncentration….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) og NIH R21CA152473 for support.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
Referências
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
