הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה
Summary
פרוטוקול לניתוח nanoparticle מעקב (נ.ת. ע) והזרימה cytometry תפוקה גבוהה להעריך חלקיקים פולימריים גן משלוח מתואר. נת"ע מנוצל כדי לאפיין את התפלגות גודל חלקיקי nanoparticle והפצת החלקיקים לפלסמיד. cytometry זרימת תפוקה גבוהה מאפשר הערכת יעילות transfection כמוני לספרייה של biomaterials מסירת הגן.
Abstract
מסירת גן ללא ויראלי באמצעות חלקיקים פולימריים התפתחה כגישה אטרקטיבית לריפוי גנטי לטיפול במחלות גנטיות 1 וכטכנולוגיה לרפואת רגנרטיבית 2. בניגוד לוירוסים, אשר יש להם בעיות בטיחות משמעותיות, חלקיקים פולימריים ניתן תוכנן להיות רעיל, אינו immunogenic, הלא מוטגניות, קל לסנתז, כימי תכליתי, מסוגל לשאת מטען גדול יותר חומצות גרעין ומתכלה ו / או לסביבה מגיב. פולימרי קטיוני עצמי להרכיב עם DNA הטעון שלילי באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית ליצירת קומפלקסים על בסדר הגודל של 100 ננומטר, מכונות חלקיקים פולימריים נפוצים. דוגמאות לחומרים ביולוגיים המשמשים ליצירת חלקיקים ננומטריים משלוח polycationic גן כוללות, polyphosphoesters polylysine, פולי (amidoamines) של וpolyethylenimine (PEI), שהוא מהמדף את שאינם מתכלה, פולימר קטיוני הנפוץ למסירת חומצות גרעין 1,3. פולי (בטא אמיניתאסתר) של (PBAEs) הוא סוג חדש יותר של פולימרי 4 קטיוני שhydrolytically מתכלה 5,6 והוכחו כיעילים במשלוח גן לסוגי תאים קשים לtransfect כגון תאים אנושיים רשתית האנדותל (HRECs) 7, תאי עכבר חלב אפיתל 8, תאי אדם סרטני במוח 9 ו macrovascular (וריד טבור אנושי, HUVECs) תאי אנדותל 10.
פרוטוקול חדש לאפיון חלקיקים פולימריים ניצול Nanoparticle מעקב וניתוח (נ.ת. ע) מתואר. בגישה זו, היא התפלגות גודל החלקיקים וההפצה של מספר פלסמידים לחלקיק מתקבלות 11. בנוסף, בדיקת תפוקה גבוהה 96 היטב צלחת transfection לסינון מהיר של יעילות transfection של חלקיקים פולימריים מוצגת. בפרוטוקול זה, (אסתר בטא אמינו) של פולי (PBAEs) משמשים כמודל פולימרים ותאי האנדותל רשתית אנושיים (HRECs) משמש כמותאים אנושיים דלים. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות להעריך כל nanoparticle פולימרים וכל סוג תא של עניין בפורמט צלחת רבה כן.
Introduction
קביעת מספר פלסמידים והמורכבים לnanoparticle חשובה לתכנן אסטרטגיות יעילות nanoparticle מבוססות גני מסירה, במיוחד לשיתוף מסירה של פלסמידים מרובים לאותו יעד תא, לעתים קרובות יש צורך בתכנות מחדש של תאי גזע מחקרים 12. גישות אחדות כדי לחשב את מספר פלסמידים הקשורים nanoparticle אחת כבר תאר, וכל גישה יש חסרונות בטכניקות המשמשות להערכה 13-16. תיוג נקודה קוונטית (QD) בשילוב עם TEM נעשה שימוש כדי לאמוד פלסמידים לחלקיקי חלקיקי chitosan מבוססים. הערכה עם טכניקת QD זה היא מסובך בשל הצורך לתייג את ה-DNA, שעשוי לשנות את תכונותיו הרכבה עצמית: האפשרות שהדנ"א ללא תווית הכמוס הוא אינו מזוהה באופן ישיר; פלסמידים וQDs בתמונות TEM 2D של חלקיקי פוטנציאל חופפים; ו הנחות מפשטות אחרות 13. גישה חלופית שהיאpplicable כאשר microdomains הורה קיים בחלקיקים נעשה שימוש כדי ללמוד מתחמי Lipopolyamine-DNA באמצעות מיקרוסקופיה קריו-אלקטרון הולכה (cryo-TEM), פיזור קרן ה-X, ופיזור אור דינמי (DLS) 14,15. למרבה הצער, חומרים כגון החלקיקים פולימריים נחקרו כאן אינם ישימים בשיטה זו. . במחקר אחר, קולינס ואח' השתמש בטכניקת זרימת חלקיקי תמונת ניתוח ללמוד (יס) 16 מתחמים המכיל פפטיד / דנ"א, אולם השיטה שלהם יכולה רק להעריך חלקיקים גדולים יותר, בגודל 16 מיקרון. לפיכך, לאחרונה פותח בדיקה חדשה וגמישה כדי לכמת את מספר פלסמידים לnanoparticle 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים הנ"ל מתארים שיטות להערכת יעילות transfection של ניסוחי nanoparticle, כמו גם דרך לאפיון גודל החלקיקים וטעינת ה-DNA של החלקיקים. מספר פלסמידים לחלקיק הוא פרמטר חשוב שיכול לעזור לנבא את היעילות של החלקיקים ויכול לשמש גם לקביעת מינון. Nanoparticle מעקב וניתוח יכול להתבצע במג?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) וNIH R21CA152473 לקבלת תמיכה.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
Referências
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
