Polymeric जीन डिलीवरी के मूल्यांकन nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और उच्च throughput प्रवाह cytometry द्वारा नैनोकणों

Summary

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) और उच्च throughput प्रवाह polymeric जीन डिलीवरी नैनोकणों का मूल्यांकन cytometry के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है. NTA nanoparticle कण आकार के वितरण और प्लाज्मिड प्रति कण वितरण को चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है. उच्च throughput प्रवाह cytometry जीन डिलीवरी biomaterials के एक पुस्तकालय के लिए मात्रात्मक अभिकर्मक प्रभावकारिता मूल्यांकन के लिए सक्षम बनाता है.

Abstract

गैर वायरल जीन polymeric नैनोकणों का उपयोग कर वितरण जीन चिकित्सा आनुवंशिक बीमारियों ¹ के इलाज के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण के रूप में और पुनर्योजी दवा ² के लिए एक प्रौद्योगिकी के रूप में उभरा है. वायरस है, जो महत्वपूर्ण सुरक्षा मुद्दों के विपरीत, polymeric नैनोकणों गैर विषैले, गैर immunogenic, गैर mutagenic आसान है, के लिए synthesize, रासायनिक बहुमुखी, बड़ा न्यूक्लिक एसिड कार्गो और biodegradable और / या पर्यावरण उत्तरदायी ले जाने में सक्षम करने के लिए तैयार किया जा सकता है. Cationic पॉलिमर electrostatic 100 एनएम कि सामान्यतः polymeric नैनोकणों कहा जाता है के आदेश पर परिसरों के रूप में बातचीत के माध्यम से नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए के साथ स्वयं को इकट्ठा. Nanoscale polycationic जीन डिलीवरी नैनोकणों किया biomaterials के उदाहरण polylysine, polyphosphoesters, पाली (amidoamines) और polyethylenimine (पी), जो एक गैर degradable बंद शेल्फ cationic बहुलक सामान्यतः न्यूक्लिक एसिड ^1,3 प्रसव के लिए प्रयोग किया जाता है. पाली (बीटा अमीनोएस्टर ओं) (PBAEs) cationic ⁴ पॉलिमर कि hydrolytically ^5,6 degradable हैं और जीन मानव रेटिना endothelial कोशिकाओं (HRECs) ^{7 के} रूप में इस तरह के मुश्किल से transfect सेल प्रकार के वितरण में प्रभावी होना दिखाया गया है के एक नए वर्ग हैं, माउस स्तन उपकला ⁸ कोशिकाओं, मानव मस्तिष्क कैंसर ⁹ कोशिकाओं और macrovascular (मानव नाल की शिरा, HUVECs) endothelial ¹⁰ कोशिकाओं.

एक नया प्रोटोकॉल nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) का उपयोग करने के लिए polymeric नैनोकणों विशेषताएँ वर्णित है. इस दृष्टिकोण में, दोनों कण आकार के वितरण और कण प्रति plasmids की संख्या का वितरण ¹¹ प्राप्त कर रहे हैं. इसके अलावा, एक उच्च throughput polymeric नैनोकणों अभिकर्मक प्रभावकारिता की तेजी से जांच के लिए 96 अच्छी तरह से थाली अभिकर्मक परख प्रस्तुत किया है. इस प्रोटोकॉल में, (बीटा अमीनो एस्टर) पाली (PBAEs) मॉडल पॉलिमर और मानव रेटिना endothelial कोशिकाओं (HRECs) के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं मो के रूप में इस्तेमाल किया जाता हैडेल मानव कोशिकाओं. इस प्रोटोकॉल आसानी से हो सकता है किसी भी polymeric nanoparticle और एक बहु – अच्छी तरह से थाली प्रारूप में ब्याज की किसी भी कोशिका प्रकार का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं.

Introduction

nanoparticle प्रति complexed plasmids की संख्या का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है सह कई plasmids के एक ही सेल लक्ष्य वितरण के लिए विशेष रूप से प्रभावी nanoparticle आधारित जीन वितरण रणनीति, डिजाइन, जैसा कि अक्सर ¹² अध्ययन reprogramming स्टेम सेल में आवश्यक है. कुछ एक nanoparticle के साथ जुड़े plasmids की संख्या की गणना करने के लिए दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है, और प्रत्येक दृष्टिकोण ^13-16 आकलन के लिए इस्तेमाल की तकनीक में कमियां है. क्वांटम डॉट (QD) मंदिर के साथ संयुक्त लेबलिंग chitosan आधारित नैनोकणों में कण प्रति plasmids का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. संभावना है कि सीधे समझाया unlabeled डीएनए का पता नहीं है, संभावित अतिव्यापी plasmids और कणों के 2d मंदिर छवियों में QDs, इस QD तकनीक के साथ आकलन के लिए डीएनए है, जो अपने स्वयं विधानसभा संपत्तियों को बदल सकता है लेबल की जरूरत की वजह से जटिल है और अन्य ¹³ को सरल बनाने मान्यताओं. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण है कि एकजब pplicable आदेश दिया microdomains कणों में मौजूद करने के लिए किया गया है क्रायो – संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो – मंदिर), एक्स – रे बिखरने और गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) ^{14,15 के} माध्यम Lipopolyamine डीएनए परिसरों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया. दुर्भाग्य से, polymeric नैनोकणों यहाँ जांच के रूप में ऐसी सामग्री इस विधि के साथ लागू नहीं कर रहे हैं. हालांकि, उनकी विधि केवल बड़े माइक्रोन आकार ¹⁶ कणों का मूल्यांकन कर सकते हैं, एक अन्य अध्ययन में, कोलिन्स एट अल एक प्रवाह कण छवि विश्लेषण तकनीक अध्ययन करने के लिए (Lys) ₁₆ युक्त पेप्टाइड / डीएनए परिसरों का इस्तेमाल किया. इस प्रकार, हम हाल ही में एक उपन्यास और लचीला ¹¹ nanoparticle प्रति plasmids की संख्या यों परख विकसित की है.

Protocol

1. सेल सीडिंग कोशिकाओं overconfluency के लिए विकसित करने की अनुमति न दें. जब प्राथमिक कोशिकाओं transfecting जल्द पारित कोशिकाओं का उपयोग करें. चौबीस घंटे अभिकर्मक करने से पहले, trypsinize कोशिकाओं, एक hemocytometer कोशिकाओं का उ…

Representative Results

चित्रा 1 प्लाज्मिड EGFP साथ HRECs की एक सफल अभिकर्मक का एक उदाहरण के एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि को दर्शाता है. brightfield छवि करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अपनी सामान्य आकारिकी को बनाए रखने…

Discussion

ऊपर प्रोटोकॉल nanoparticle योगों के अभिकर्मक प्रभावकारिता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक कण आकार और नैनोकणों के डीएनए लोड विशेषताएँ का मूल्यांकन करने की विधियों का वर्णन करते हैं. कण प्रति plasmids की संख्या…

Materials

			Reagent
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS)	Invitrogen	10010
EGM-2MV BulletKit	Lonza	CC-3202
Trypsin	Invitrogen	25300
Sodium acetate buffer	Sigma-Aldrich	S7899	Dilute to 25mM in deionized water
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855
pEGFP DNA	Elim Biopharmaceuticals	NA
DsRed DNA	Addgene	21718
PEI, branched	Sigma-Aldrich	408727
CellTiter 96 AQueous One	Promega	G3580
			Materials
Clear flat bottom 96-well plate, sterile	Sarstedt	82.1581.001
Clear round bottom 96-well plate, sterile	Sarstedt	82.1582.001
12-channel Finnpipette	Thermo Scientific	NA	5-50 and 50-300 μl
Fluorescence Microscope	Zeiss	NA	Model number: AX10
C6 Accuri flow cytometer	BD Biosciences	NA
HyperCyt attachment	Intellicyt	NA
NS500	Nanosight	NA