ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価
Summary
ナノ粒子トラッキング解析（NTA）とポリマー遺伝子送達ナノ粒子を評価するためのハイスループットフローサイトメトリーのためのプロトコルが記載されている。国税庁は、ナノ粒子の粒度分布およびプラスミド当たり粒子分布を特徴付けるために利用される。ハイスループットフローサイトメトリーは、遺伝子送達バイオマテリアルのライブラリの定量的なトランスフェクション効率の評価を可能にします。
Abstract
高分子ナノ粒子を用いた非ウイルス遺伝子送達は、遺伝性疾患1、再生医療2技術としての治療に遺伝子治療のための魅力的なアプローチとして浮上している。重大な安全上の問題を抱えているウイルスとは異なり、高分子ナノ粒子を化学的、多目的な大きな核酸貨物を運ぶことができるし、生分解性および/または環境対応、合成するために、非毒性、非免疫原性、非変異原性、より簡単になるように設計することができます。カチオン性ポリマーは、一般に高分子ナノ粒子と呼ばれる100nmのオーダーで複合体を形成するために、静電相互作用を介して、負に荷電したDNAを用いて自己組織化する。ナノスケールポリカチオン性遺伝子送達ナノ粒子を形成するために用いられる生体材料の例としては、ポリリジン、polyphosphoesters、ポリ（アミドアミン）sと一般的に核酸送達1,3に使用される非分解既製のカチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン（PEI）を含む。ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）は、5,6加水分解性であり、そのような人間の網膜血管内皮細胞（HRECs）7などのハードへのトランスフェクション細胞型への遺伝子送達に有効であることが示されているカチオン性ポリマー4の新しいクラスであるマウス乳腺上皮細胞8、人間の脳のがん細胞9および10の大血管障害（ヒト臍帯静脈、HUVECを）内皮細胞。
ナノ粒子トラッキング解析（NTA）を利用した高分子ナノ粒子を特徴付けるための新しいプロトコルが記載されている。このアプローチでは、粒度分布と粒子あたりのプラスミドの数の分布の両方が11を得られる。さらに、ポリマーナノ粒子のトランスフェクション効率の迅速なスクリーニングのためのハイスループットの96ウェルプレートのトランスフェクションアッセイが提示される。このプロトコルでは、ポリ（β-アミノエステル）（PBAEs）をモデルポリマーおよびヒト網膜内皮細胞（HRECs）として使用されているMOとして使用されているデルヒト細胞。このプロトコルは、簡単に任意の高分子ナノ粒子およびマルチウェルプレートフォーマットの関心の任意の細胞型を評価するために適合させることができます。
Introduction
ナノ粒子あたりの複合体化プラスミドの数の決定は、特に同じ細胞標的に多数のプラスミドの共同配信のための効果的なナノ粒子ベースの遺伝子送達戦略を設計することが重要である、などがしばしば研究12を再プログラム幹細胞が必要である。単一ナノ粒子に関連付けられたプラスミドの数を計算するためのいくつかのアプローチについて説明し、それぞれのアプローチは、推定13から16に用いられる技術の欠点を持っているされています。 TEMと組み合わせ量子ドット（QD）標識は、キトサンをベースとしたナノ粒子の粒子あたりのプラスミドを推定するために使用されています。カプセル化された非標識のDNAを直接検出されていない可能性;、この量子ドット技術を用いた推定が原因で、その自己アセンブリのプロパティを変更することができるDNAを標識する必要に複雑になる可能性のある粒子の2次元TEM像でプラスミドおよび量子ドットの重複、および他の単純な仮定13。ある代替的アプローチpplicable命じたマイクロドメインは、粒子内に存在する場合は低温透過型電子顕微鏡（クライオTEM）、X線散乱、動的光散乱（DLS）14,15を介して、リポ-DNA複合体を研究するために使用されています。残念ながら、そのようなここで検討高分子ナノ粒子などの材料は、このメソッドを使用して適用されません。別の研究では、Collins らが勉強するために、フロー式粒子像分析技術（Lys）の16含有ペプチド/ DNA複合体を用いているが、それらの方法は、大きく、ミクロンサイズの粒子16を評価することができます。したがって、我々は最近、ナノ粒子あたり11プラスミドの数を定量化するための斬新かつ柔軟なアッセイを開発した。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルは、上記のナノ粒子製剤のトランスフェクション効率だけでなく、ナノ粒子の粒径およびDNAロードを特徴付けるための方法を評価する方法について説明します。粒子あたりのプラスミド数は、粒子の有効性を予測するのを助けることができる重要なパラメータであり、また、線量測定のために使用することができます。ナノ粒子トラッキング解析は、塩濃度の異なるものなど、さ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、サポートのためにTEDCO MSCRF（2009-MSCRFE-0098-00）およびNIH R21CA152473に感謝します。
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
Referências
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