Utvärdering av polymera Gene Delivery nanopartiklar genom nanopartikel Tracking Analys och hög kapacitet flödescytometri
Summary
Ett protokoll för nanopartiklar spårning analys (NTA) och hög genomströmning flödescytometri för att utvärdera polymera nanopartiklar gentillförsel beskrivs. NTA används för att karakterisera nanopartiklar partikelstorleksfördelningen och plasmiden per partikelfördelningen. Hög genomströmning flödescytometri möjliggör kvantitativ utvärdering transfektion effektivitet för ett bibliotek av biomaterial gentillförsel.
Abstract
Icke-viral gen leverans med polymera nanopartiklar har blivit en attraktiv metod för genterapi för att behandla genetiska sjukdomar 1 och som en teknik för regenerativ medicin 2. Till skillnad från virus, som har betydande säkerhetsfrågor, kan polymera nanopartiklar utformas för att vara icke-toxiska, icke-immunogena, icke-mutagena, lättare att syntetisera, kemiskt mångsidig, kan bära större nukleinsyra last och biologiskt nedbrytbart och / eller miljömässigt mottaglig. Katjoniska polymerer själv montera med negativt laddad DNA via elektrostatisk växelverkan att bilda komplex av storleksordningen 100 nm, som vanligen benämns polymera nanopartiklar. Exempel på biomaterial som används för att bilda nanonivå polykatjoniska nanopartiklar gentillförsel inkluderar polylysin, polyphosphoesters, poly (amidoaminer) s och polyetylenimin (PEI), som är en icke-nedbrytbar off-the-shelf katjoniska polymeren som vanligen används för nukleinsyra leverans 1,3. Poly (beta-amino-ester) s (PBAEs) är en nyare klass av katjoniska polymerer 4 som är hydrolytiskt nedbrytbara 5,6 och har visat sig vara effektiva vid genleverans till svåra att transfektera celltyper såsom humana retinala endotelceller (HRECs) 7, mus mammära epitelceller 8, mänskliga hjärnan cancerceller 9 och makrovaskulära (mänsklig navelven, HUVEC) endotelceller 10.
Ett nytt protokoll för att karakterisera polymera nanopartiklar använder nanopartiklar spårning analys (NTA) beskrivs. I detta tillvägagångssätt, är både partikelstorleksfördelningen och fördelningen av antalet plasmider per partikel erhållen 11. Dessutom är en hög genomströmning 96-brunnars platta transfektionsanalysen för snabb screening av transfektion effekten av polymera nanopartiklar presenteras. I detta protokoll är poly (beta-aminoester) s (PBAEs) som används som modell polymerer och mänskliga retinala endotelceller (HRECs) används som model humana celler. Detta protokoll kan enkelt anpassas för att utvärdera eventuella polymera nanopartiklar och vilken celltyp som helst av intresse i en platta med flera brunnar formatet.
Introduction
Fastställandet av antalet plasmider komplexbundna per nanopartiklar är viktigt att utforma effektiva nanopartiklar baserade strategier gentillförsel, särskilt för samarbete leverans av flera plasmider i samma cell mål, ofta krävs i stamceller omprogrammering studier 12. Få metoder för att beräkna antalet plasmider som är förknippade med en enda nanopartikel har beskrivits, och varje metod har nackdelar i de tekniker som används för skattning 13-16. Quantum dot (QD) märkning i kombination med TEM har använts för att uppskatta plasmider per partikel i kitosan-baserade nanopartiklar. Skattning med denna QD teknik är komplicerat på grund av behovet att märka DNA, som kan förändra sina självorganisering egenskaper, möjligheten att inkapslade omärkt DNA inte direkt detekteras; potentiellt överlappande plasmider och QDs i 2D TEM-bilder av partiklar, och andra förenklande antaganden 13. Ett alternativt tillvägagångssätt som är enpplicable när beställda mikroområden finns i partiklarna har använts för att studera lipopolyamin-DNA-komplex via kryo-transmissionselektronmikroskopi (kryo-TEM), X-ray scattering, och dynamisk ljusspridning (DLS) 14,15. Tyvärr, material såsom de polymera nanopartiklar undersökta här är inte tillämpliga med denna metod. I en annan studie använde Collins et al ett flöde partikel teknik bildanalys för att studera (Lys) 16-innehållande peptid / DNA-komplex,. Kan dock deras metod endast utvärdera större, mikrometerstorlek partiklar 16. Därför utvecklade vi nyligen en ny och flexibel analys för att kvantifiera antalet plasmider per nanopartiklar 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen ovan beskriver metoder för utvärdering av transfektion effekten av nanopartiklar formuleringar, liksom ett sätt att karakterisera partikelstorleken och DNA lastning av nanopartiklar. Antalet plasmider per partikel är en viktig parameter som kan hjälpa till att förutsäga effektiviteten av partikeln och kan också användas för bestämning dos. Nanopartiklar spårning analys kan utföras i en rad olika vattenhaltiga lösningar, såsom de som skiljer sig i saltkoncentration. Ofta denna karakterisering u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) och NIH R21CA152473 stöd.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
Referências
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
