Ein orthotopen Blasenkrebs-Modell für Gene Delivery Studies

Summary

Implantation von Krebszellen in das Ursprungsorgan als nützliches präklinischen Modell, um neue Therapien zu evaluieren zu dienen. MB49-Blasenkarzinomzellen in der Blase nach intravesikale Instillation gezüchtet werden. Dieses Protokoll zeigt, Katheterisierung der Blase der Maus für die Zwecke der Tumorimplantation und adenoviraler Lieferung.

Abstract

Blasenkrebs ist die zweithäufigste Krebserkrankung des Urogenitaltraktes und neue therapeutische Ansätze, die eine Wiederkehr zu reduzieren und das Fortschreiten benötigt werden. Der Tumor-Mikroumgebung wesentlich beeinflussen können Tumorentstehung Antwort. Es ist daher oft wünschenswert, um Tumorzellen in das Organ, von dem sie stammen, zu wachsen. Dieses Protokoll beschreibt eine orthotope Modell von Blasenkrebs, in der MB49 murinen Blasenkarzinom-Zellen werden über Katheter in die Blase instilliert. Erfolgreiche Implantation der Tumorzellen in diesem Modell erfordert Unterbrechung des Schutz Glycosaminoglycan Schicht, die durch physikalische oder chemische Mittel erreicht werden können. In unserem Protokoll die Blase mit Trypsin vor der Zell Instillation behandelt. Katheterisierung der Harnblase kann auch zur Therapie liefern, sobald die Tumoren etabliert werden wird. Dieses Protokoll beschreibt die Bereitstellung eines adenoviralen Konstrukts, das ein Luciferase-Reporter-Gen exprimiert. Während our-Protokoll wurde für den Kurzzeitstudien optimiert und konzentriert sich auf die Gen-Lieferung, die Methodik der Maus Blasenkatheter hat breite Anwendungen.

Introduction

Blasenkrebs ist die zweithäufigste Krebserkrankung des Urogenitaltraktes mit fast 75.000 Neuerkrankungen und 15.000 Todesfällen im Jahr 2012 ¹ erwartet. Hohe Rezidivraten erfordern lebenslanges Follow-up, die Blasenkrebs eines der teuersten Krebsarten behandelbar machen. Blasenkrebs, die die Muskelschicht eingedrungen hat, kann zu Leber-, Lungen-oder Knochen über das Lymphsystem metastasieren. Multimodale Therapie von fortgeschrittenen Tumoren führt nur zu 20-40% Überlebensrate nach 5 Jahren. Daher sind effektive Behandlungsstrategien zur Verringerung des Wiederauftretens und Progression der oberflächlichen Blasenkrebs sowie die Verbesserung der Therapieergebnisse bei Patienten mit fortgeschrittener Krankheit abzielen dringend erforderlich.

Entwicklung neuartiger Therapeutika erfordert präklinischen Modellen zur Beurteilung der Wirksamkeit nach der ersten in-vitro-Beurteilung. Der Tumor-Mikroumgebung wesentlich beeinflussen können Krebsentwicklung und Reaktionsfähigkeit, die die Notwendigkeit für Präklinik hebtal Modelle, in denen Tumoren entstehen oder in der Ursprungsorgan eingerichtet werden. Ein Ansatz ist die Entwicklung von transgenen Modellen, in denen Tumore spontan auftreten oder können in einer organspezifischen Weise induziert werden. Eine hervorragende Protokoll einer transgenen Blasenkrebs-Modell wurde vor kurzem veröffentlicht ^2. Der Nachteil von transgenen Modellen ist, dass Tumoren neigen dazu, langsam und mit weniger Einheitlichkeit als gewünscht zu entwickeln. Darüber hinaus hat die Kosten der Aufrechterhaltung einer Zuchtkolonie zu berücksichtigen. Eine Alternative zu transgenen Modellen orthotope Implantation von Tumorzellen, die den Vorteil der kurzen Zeitrahmen für die Tumoretablierung im Handel erhältlich Mäusen hat. Während einige menschliche Blasenkarzinom Zelllinien können orthotopisch gezüchtet werden (die wir erfolgreich verwendet UM-UC-3), kann es wünschenswert sein Tumoren in immunkompetenten Mäusen zu etablieren. Zwei murinen Blasenkrebszelllinien, die orthotop wachsen MBT-2 und ³ MB49. Da MBT-2-Zellen mit replizierenden verunreinigtTyp C Retrovirus ^4, haben wir MB49-Zellen, die für unsere Untersuchungen ausgewählt. Es ist wichtig zu beachten, daß MB49-Zellen wurden aus einer männlichen Maus isoliert und orthotope Implantation sind aus anatomischen Gründen in weiblichen Mäusen durchgeführt. Dies hat den Vorteil der einfachen Identifizierung der implantierten Zellen durch Marker des Y-Chromosoms, aber die Fehlanpassung Geschlecht kann ein Nachteil für immunologische Untersuchungen sein.

Die Blase Epithel wird durch eine Glycosaminoglycan (GAG)-Schicht, die als Barriere für eine Infektion durch Mikroorganismen fungiert ausgekleidet. Diese Barriere kann auch mit der Implantation der Tumorzellen und mehrere Verfahren stören entwickelt worden, um diese Schwierigkeit zu (Tabelle 1) zu überwinden. Elektrokauter wurde ausgiebig als physikalische Mittel, um die GAG-Schicht ^5-13 und ein Protokoll zeigt, Elektrokauter hat vor kurzem in JoVE ¹⁴ veröffentlicht worden stören eingesetzt. Allerdings sollte ein Elektrokauter Gerät nicht verfügbar sein, bedeutet, um die chemischen G zerstörenAg-Schicht, wie Silbernitrat oder Poly-L-Lysin kann auch verwendet werden, ^15-24. Tumoren wirksam durch eine kurze Belichtung der Blase auf ein kleines Volumen von Silbernitrat fest (5-10 ul 0,15-1,0 M, ~ 10 Sekunden) oder länger Kontakt mit Poly-L-lysin (100 ul 0,1 mg / ml 20 min) (Tabelle 1). Hier beschreiben wir eine Methode, die Trypsin verwendet, um die Implantation von MB49-Zellen zu erleichtern.

In einem Versuch, therapeutische Ansätze für Blasenkrebs zu verbessern, hat die Gentherapie erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Aus klinischer Sicht ist Blasenkrebs ein ideales Ziel für die Gentherapie durch die einfache Zugänglichkeit der Orgel und die Möglichkeit, vor Ort die Nutzlast liefern. Virale Vektoren, die für Blasenkrebs Gentherapie erforscht worden sind, schließen eine onkolytischen Herpes-simplex-Virus ^{25, 26} Retrovirus, Kanarienpockenvirus ^27, Vaccinia-Virus, AAV und adenoviruS ^28. Im zweiten Teil des Protokolls, beschreiben wir ein Verfahren für die virale Liefer, die praktisch identisch mit der Instillation der Tumorzellen ist. Von Interesse in unserem Labor ist die Entwicklung von neuartigen Ansätzen zur Gen-Lieferung, die wir beurteilen, über Biolumineszenz mit einer Adenovirus-Vektor, der ein Transgen Luciferase ausdrückt. Jedoch kann die Methodik der Blasenkatheter zur Abgabe von verschiedenen Mitteln verwendet werden und hat daher eine breite Anwendbarkeit.

Protocol

Alle Verfahren, die Tiere sind überprüft worden und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Medizinischen Universität von South Carolina genehmigt. Das Protokoll wurde unter USDA Kategorie D für Schmerzen zugelassen. 1. Zellimplantation Zwei Tage vor der Durchführung des Verfahrens, Platte 1 x 10 6 Zellen in MB49-T-25-Kolben. Verwenden DMEM high glucose, ergänzt mit 10% FBS (und Antibiotika, falls gewünscht). Ein Kolben ist ausreic…

Representative Results

Hämaturie ist in fast alle Mäuse innerhalb von 8 Tagen nach der Implantation von 200.000 MB49-Zellen beobachtet. Wie in Abbildung 1 gezeigt, Blasengewicht mehr als verdoppelt von 34,7 ± 3,3 mg (Bereich 31 bis 37 mg, n = 4) in nontumor tragenden Mäusen auf 87,5 ± 19,2 mg (Bereich von 77 bis 120 mg, n = 10) bei Mäusen, die wurden mit MB49-Zellen implantiert. In Bezug auf die Gen-Lieferung, fanden wir, dass die Abbildung Mäuse 24 Stunden nach der Virus Einträufeln ergibt ein stärkeres Signal als n…

Discussion

Die in diesem Protokoll beschriebenen primären Methodik ist Katheterisierung der Maus Blasen, die breite Anwendungen zur Instillation von Zellen oder der Agenten, für die lokale Zustellung in die Blase Epithel bestimmt hat. Die spezifische Protokoll oben skizzierten für Kurzzeitstudien (~ 10 Tage) optimiert. Implantieren der genauen Anzahl der Zellen ist kritisch, da eine höhere Anzahl von Zellen in schneller Tumorwachstum und möglicherweise Verlust von Tieren durch große Tumorbelastung führen. Mit 200.000 MB49-Z…

Materials

Name of reagent	Company	Catalog number	Comments
6-8 week old female mice	Jackson Laboratories	Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664
Trypsin*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtained through Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtained through Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	Heat-inactivated
T25 flasks*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtained through Fisher
MB49 cells	N/A	N/A	Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtained through Fisher
Depilatory cream: Veet	local pharmacy
Lubricant: K-Y Jelly	local pharmacy
Catheters*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtained through Fisher
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtained though hospital pharmacy
1 ml slip tip TB syringes	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferin	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use	Infectious agent that requires BSL2 containment
Steady-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Material name	Company	Catalog number	Comments
Anesthesia system	E-Z Systems, Euthanex Corporation	Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109	Obtained through Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2