Optogenética estimulação do comportamento de fuga em<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Ferramentas optogenética codificados geneticamente permitir a manipulação não invasiva de neurónios específicos no<em> Drosophila</em> Cérebro. Tais ferramentas podem identificar neurónios cuja activação é suficiente para induzir ou suprimir determinados comportamentos. Aqui apresentamos um método para ativar Channelrhodopsin2 que se expressa em neurônios específicos em moscas livremente a pé.
Abstract
Um número crescente de ferramentas codificados geneticamente estão ficando disponíveis que permitem não invasivo manipulação da actividade neural de neurónios específicos em Drosophila melanogaster 1. A principal delas são ferramentas optogenética, que permitem a ativação ou silenciamento de neurônios específicos no animal intacto, e movendo-se livremente com luz brilhante. Channelrodopsina (CHR2) é um canal de catião activado pela luz, que, quando activada pela luz azul, provoca a despolarização dos neurónios que expressam. Chr2 tem sido eficaz para a identificação de neurônios críticos para comportamentos específicos, tais como o CO 2 evasão, extensão e tromba gigante de fibra resposta de sobressalto mediada 2-4. No entanto, como as fontes de luz intensa, utilizados para estimular a CHR2 também estimular fotorreceptores, estas técnicas optogenética não tenham sido previamente utilizados no sistema visual. Aqui, nós combinamos uma abordagem optogenética com uma mutação que prejudica fototransdução a demonstrate que a ativação de um cluster de tear neurônios sensíveis em lobo óptico da mosca, foma-1 neurônios, pode dirigir um comportamento de fuga usado para evitar a colisão. Utilizou-se um alelo nulo de um componente crítico da cascata de fototransdução, fosfolipase C-β, codificada pelo gene norpA, para tornar a voa cego e também utilizar o Gal4-UAS sistema activador transcricional para comandar a expressão de CHR2 no Foma-1 neurônios. Moscas individuais são colocados em uma pequena plataforma cercada por LEDs azuis. Quando os LEDs são iluminadas, as moscas rapidamente descolagem em voo, de um modo semelhante ao comportamento visual impulsionada tear-escape. Nós acreditamos que esta técnica pode ser facilmente adaptada para analisar outros comportamentos em se movimentar livremente moscas.
Introduction
A crescente arsenal de ferramentas geneticamente codificados têm sido desenvolvidos para manipular actividade neural em células específicas na Drosophila melanogaster 1. Estas ferramentas permitem a ativação não-invasiva ou silenciamento de neurônios específicos no animal intacto, e se movimentar livremente. Entre estes, Channelrhodopsin2 (CHR2), um canal de catião activado pela luz, apresenta vantagens importantes, uma vez que pode ser temporalmente controlado e rapidamente induzido. Quando os neurônios que expressam chr2 estão expostos a brilhante luz azul (470 nm), eles rapidamente despolarizar e apresentam elevadas taxas de disparo 3-5. Ativação de neurônios como alvo específicos em animais livremente móveis revelou a suficiência de neurônios específicos para comportamentos como evitar CO 2 3, tromba extensão 2,4, ea gigante de fibra respostas de alarme mediadas 4. No entanto, como as fontes de luz intensa necessárias para estimular CHR2 também estimular fotorreceptores, aplicando optogenetic técnicas para o sistema visual tem sido limitada. Através da combinação de uma abordagem optogenética com uma mutação que prejudica a fototransdução, nós demonstramos que a activação de um conjunto específico de neurónios no lóbulo óptico da mosca pode conduzir a um comportamento de escape utilizado para evitar a colisão 6.
A maioria, se não todos, os animais visuais exibem um comportamento de fuga para evitar colisões com objectos que se aproximam. Andar a pé ou parado moscas, quando se apresenta com uma colisão iminente, o arranque em vôo, longe da colisão iminente 7-9. Estes decolagens caracterizam-se por asas levantadas antes da descolagem e uma trajetória de vôo instável 10,11. Esta resposta é distinto do gigante fibra resposta mediada sobressalto, saltos que não são precedidos por asas levantados, e, normalmente, resultaria em uma queda em queda livre 4,9. Tendo identificado um cluster específico de neurônios sensíveis tear no lobo óptico, Foma-1 neurônios, que são uniquely atento para codificar objetos que se aproximam, procurou-se investigar o seu envolvimento na mosca comportamento de fuga tear. Aqui demonstramos o uso de optogenética para ativar seletivamente esses neurônios e provocar o comportamento da mosca fuga.
Usamos o Gal4-UAS sistema activador transcricional de dirigir a expressão de CHR2-nos uma foma neurónios. Chr2 requer o co-fator todo-trans-retinal e como esta é encontrada em níveis baixos no sistema central nervoso Drosophila deve ser completado na dieta das moscas. 3,4 Como a luz brilhante é usado para ativar chr2 e moscas exibem comportamentos phototactic fortes 12, procurou-se eliminar a possibilidade de uma resposta visual ao estímulo. Para fazer isto, utilizou-se animais que eram mutantes homozigóticos para um alelo nulo do gene norpA, que codifica um componente crítico da cascata de fototransdução, fosfolipase C-β. Fotorreceptores em tais moscas mutantes são incapazes de responsabilidaded a luz 13. Para testar a estimulação optogenética da resposta de fuga, é necessário isolar uma única mosca e banhar em luz azul brilhante. Para fazer isso, nós colocamos moscas individuais em pontas de pipeta. Uma ponta de pipeta é colocada num suporte personalizado, de tal modo que a mosca vai geotactically subida da ponta e para fora para uma plataforma rectangular. A mosca é capaz de caminhar livremente em cima desta plataforma. A plataforma está rodeada por quatro matrizes de LED azul, cada um contendo três LEDs, voltadas para o topo da plataforma. Depois da passagem está na plataforma, os LEDs são iluminados, e resposta da mosca é gravado usando uma câmera de alta velocidade 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós demonstramos estimulação optogenética de comportamentos de fuga, banhando livremente caminhar moscas em luz azul brilhante. Esta abordagem pode ser facilmente adaptada para analisar outros comportamentos em moscas livremente a pé, e pode ser escalado para plataformas maiores, simplesmente ladrilhos as matrizes de LED que usamos em uma área maior. Usando uma câmera barata do que descrever, ou outros sistemas de câmera disponíveis, o usuário pode ajustar a taxa de quadros e resolução espacial das ima…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma bolsa Dean Stanford (SEJdV), dos Institutos Nacionais de Saúde Prêmio Diretor Pioneer (TRC DP0035350), um Prêmio Fundação McKnight estudioso (TRC) e R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
Referências
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O’Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
