Usando cuantitativa en tiempo real PCR para determinar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo Trasplante de médula ósea murina

Summary

Determinación de quimerismo de células donantes presenta un reto en modelos de ratón trasplante de médula ósea que carecen bien definidos marcadores fenotípicos. Se presenta una metodología para cuantificar injerto macho donante de células en ratones hembras receptoras de trasplante. Este método se puede utilizar en todas las cepas de ratón para el estudio de funciones HSC.

Abstract

Murino de trasplante de médula ósea modelos constituyen una herramienta importante en la medición de células madre hematopoyéticas (HSC) y los genes que determinan las funciones / moléculas que regulan las CMH. En estos sistemas modelo de trasplante, la función de HSCs se determina por la capacidad de estas células a ratones injertan y reconstituir receptores irradiados letalmente. Comúnmente, la célula donante contribución / injerto se mide por los anticuerpos específicos de donante-proteínas de superficie celular por citometría de flujo. Sin embargo, este método depende en gran medida de la especificidad y la capacidad del marcador de superficie celular para diferenciar las células derivadas del donante de células receptoras originados, que pueden no estar disponibles para todas las cepas de ratón. Teniendo en cuenta los diversos antecedentes de cepas de ratón genéticamente modificados en el mercado, esta superficie de la célula / citometría de flujo basado en el método tiene limitaciones importantes, especialmente en las cepas de ratón que carecen bien definidos marcadores de superficie de células donantes separados de congenic destinatario cells. Aquí, se informó de una técnica basada en PCR para determinar quimerismo de células donantes / contribución en los ratones receptores de trasplante. Hemos trasplantado machos donantes de médula ósea a HSCs irradiados letalmente ratones hembra congénicos. Muestras de sangre periférica fueron recolectadas en diferentes tiempos después del trasplante puntos. Muestras de médula ósea se obtuvieron al final de los experimentos. ADN genómico se aisló y el gen específico de cromosoma Y, Zfy1, se amplificó utilizando PCR en tiempo real cuantitativa. El injerto de los machos células derivadas del donante en los ratones receptores hembra se calculó contra curva estándar con un porcentaje conocido de los ADN macho contra hembra. Bcl2 se utilizó como gen de referencia para normalizar la cantidad de ADN total. Nuestros datos sugiere que este enfoque fiable determina quimerismo de células donantes y proporciona un método útil, pero sencillo en la medición de la reconstitución de células hematopoyéticas en modelos murinos trasplante de médula ósea. Nuestro método puede ser realizada de forma rutinaria en la mayoría de los laboratorios porque noequipos costosos tales como la citometría de flujo se requiere.

Introduction

Murino médula ósea (MO) trasplante modelo fue desarrollado por primera vez en 1960 ^1. Este modelo se ha usado ampliamente para el estudio de células madre de un donante hematopoyéticas (HSC) biología en un ratón receptor host. Médula ósea murina modelo de trasplante nos ha proporcionado valiosa información sobre las funciones de HSC y su regulación y es indispensable en la investigación HSC. Alogénico de médula ósea como modelo de transplante C57Bl/6J ^H2B-Balb / C ^H2d o modelo de trasplante congenic como C56Bl/6J ^{CD45.2-B6.SJL CD45.1} se utilizan en muchos laboratorios para estudiar la función de genes en la actividad HSC ^2, el efecto de fármaco de tratamiento de enfermedades de función HSC ³ o trasplante relacionados, tales como la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) ^4.

Marcadores de superficie celular tales como haplotipo MHC o CD45.1 son comúnmente utilizados para distinguir las células derivadas del donante de células receptoras-originaron. C57Bl/6J ^{H2b, CD45.2} </sup>, Balb / C ^H2d y ^CD45.1 B6.SJL son las cepas de ratón más comúnmente usados ​​en el trasplante de médula ósea debido a que la contribución de donantes de células pueden ser fácilmente evaluada por citometría de flujo midiendo vs CD45.1 o CD45.2 H2b vs H2D. Sin embargo, muchas otras cepas como FVB / NJ ⁵ y C3H también se utiliza a menudo para generar transgénicos o genéticamente ratones knockout. Estos ratones pueden ser retrocruzaron a una línea consanguínea y mantenido en una genético mixto / MHC fondo. En estos casos, la determinación de quimerismo de células donantes y la función HSC podría ser difícil como donante específico de células marcadores de superficie puede no estar disponible.

Utilizando Y-cromosoma sonda específica de ADN para detectar las células del donante masculino por Southern blot en el sexo no coincide el trasplante de médula ósea ha sido desarrollado por el grupo del Dr. Miwa ^6. Entonces, una PCR en tiempo real para la región Y determinante del sexo se encontró que era un método preciso y altamente específico para cuantificar male células fetales en la sangre materna sistema ^7. Este concepto fue adaptado por el grupo del Dr. Schwarzenberger para el desarrollo de una técnica de PCR en tiempo real en un modelo de trasplante de médula ósea murina para determinar quimerismo de células donantes ^8. Hemos modificado adicionalmente este método para la medición de quimerismo de células donantes en FVB / NJ modelo de trasplante de médula ósea de ratón. Este método actualmente es ampliamente utilizado en nuestro grupo para estudiar el papel de Pim1 quinasa en biología HSC.

Protocol

1. Bone Marrow celda de aislamiento Eutanasiar donantes masculinos FVB / NJ ratones y hembra FVB / NJ ratones utilizando CO 2 método seguido por dislocación cervical. La hembra FVB / NJ células de médula ósea se utiliza como células competitivas. Utilice pequeñas tijeras y pinzas, diseccionar el fémur y tibiaes de ratones y colocarlos en una placa de cultivo tisular de 60 mm que contiene 6 ml de helado de RPMI1640 con FBS inactivado por calor al 5%. Utilizar tejido Kimwipe para el…

Representative Results

La Figura 1 y 2 mostraron ejemplos de las curvas de calibración trazada con valores medios de 2-? Ct contra porcentajes de ADN masculino. Figura 1A muestra la temperatura de fusión específica para Bcl2 y Zfy1 amplicones localizados a 78,5 ° C y 88,5 ° C, respectivamente. Bcl2 se utiliza como un gen de referencia para normalizar la cantidad total de ADN cargado en cada reacción de PCR. Bcl2 curvas de amplificación (vista de registro) para cada muestra estándar fusionar…

Discussion

El objetivo de nuestro estudio es proporcionar a los espectadores una técnica basada en PCR para cuantificar quimerismo de células donantes en un modelo competitivo trasplante de médula ósea murina. Varios estudios han descrito el uso de RT-PCR para detectar células del donante en modelos de trasplante ^9-10. El grupo del Dr. Schwarzenberger la primera desarrollado un trasplante de médula ósea murina modelo de trasplante usando PCR en tiempo real para amplificar y-cromosoma específico ^8. Est…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
RPMI 1640	Hyclone	SH30255.01
FBS	Invitrogen	16140-017	Heat inactivated
Ammonium chloride	MP Biomedicaals	194806
Potassium Bicarbonate	Fisher	P184-500
QIAamp DNA Blood minikit	Qiagen	51106
Cell strainer	BD bioscience
iQ SYBR Green supermix	Biorad	170-8882
iQ5 real time PCR machine	Biorad
Spectra photometer	Nanodrop ND-1000	ND-1000