Neonatal subventricular Zone Electroporation
Summary
Vi viser en minimalt invasiv teknikk kalt neonatal subventricular sone electroporation. Teknikken består i innsprøyting plasmid DNA inn i laterale ventrikkel av neonatale valper og tilføre elektrisk strøm for å levere og genetisk manipulere nevrale stamceller
Abstract
Nevrale stamceller (NSCs) linje postnatal sideventriklene og gi opphav til flere celletyper som inkluderer nevroner, astrocytes og ependymal celler en. Forstå de molekylære veier som er ansvarlige for NSC selvfornyelse, engasjement og differensiering er kritisk for å utnytte deres unike potensial til å reparere hjernen og bedre forstå sentrale nervesystemet lidelser. Tidligere metoder for manipulering av pattedyr systemer kreves det tidkrevende og dyrt bestrebelse av genteknologi ved hele dyret nivå 2. Dermed har det store flertallet av studier utforsket funksjonene NSC molekyler in vitro eller in virvelløse dyr.
Her viser vi den enkle og raske teknikk for å manipulere neonatal NPCer som er referert til som neonatal subventricular sone (SVZ) electroporation. Lignende teknikker ble utviklet for et tiår siden for å studere embryonale NSCs og har hjulpet studier på cortical utvikling 3,4. Mer nylig denne ble brukt til å studere postnatal gnager forebrain 5-7. Denne teknikken resulterer i robust merking av SVZ NSCs og deres avkom. Dermed gir postnatal SVZ electroporation en kostnadseffektiv og tidsbesparende alternativ for pattedyr NSC genteknologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her har vi detalj teknikken neonatal SVZ electroporation, en teknikk for å raskt og robust merke og manipulere SVZ stamceller og deres avkom. Det er flere fordeler som elektroporering har i forhold til andre teknikker. Først, gitt fokal merking av celler, er man i stand til å skjelne celle selvstyrte og ikke-celle autonome effekter. Sekund, genetisk manipulasjon hjelp induserbare systemer tillater en å sammenligne effekter før eller etter synaptiske integrasjon. Videre kan man omgå bruken av flere plasmider ved el…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Department of Defense (Idéutvikling award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stamcelleforskningen stipend (AB), og en National Institute of Health NRSA 10668225 (DMF). Det foreliggende materiale er basert på arbeid delvis støttet av staten Connecticut under Connecticut Stem Cell Research Grants Program. Innholdet er utelukkende ansvaret av forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle syn i staten Connecticut, Department of Public Health i delstaten Connecticut eller CT Innovations, hadde Inc. organer ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
Referências
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
