Neonatal subventrikulära zonen Elektroporering
Summary
Vi visar en minimalinvasiv teknik kallas neonatal subventrikulära zonen elektroporering. Tekniken består av injicera plasmid-DNA i de laterala ventriklarna hos neonatala valpar och applicera elektrisk ström för att leverera och genetiskt manipulera neurala stamceller
Abstract
Neurala stamceller (NSC) linje den postnatala laterala ventriklarna och ger upphov till flera celltyper som inkluderar neuroner, astrocyter och ependymala celler 1. Kunskap om de molekylära vägar som är ansvariga för NSC självförnyelse, engagemang och differentiering är avgörande för att utnyttja deras unika möjligheter att reparera hjärnan och bättre förstå centrala nervsystemet. Tidigare metoder för manipulering av däggdjurssystem krävde tidsödande och dyr strävan av genteknik på hela djuret nivå 2. Sålunda har de allra flesta studier undersökte funktioner NSC molekyler in vitro eller i ryggradslösa djur.
Här visar vi de enkelt och snabbt teknik för att manipulera neonatala NPC som kallas neonatal subventrikulära zonen (SVZ) elektroporering. Liknande tekniker utvecklades för tio år sedan för att studera embryonala NSCs och har hjälpt studier om corticaL utveckling 3,4. Mer nyligen detta tillämpades för att studera den postnatala gnagare framhjärnan 5-7. Denna teknik resulterar i robusta märkning av SVZ NSCs och deras avkomma. Således ger födsel SVZ elektroporering en kostnads-och tidseffektivt alternativ för däggdjur NSC genteknik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här vi detalj tekniken av neonatal SVZ elektroporering, en teknik för att snabbt och robust märka och manipulera SVZ stamceller och deras avkomma. Det finns flera fördelar som elektroporering har i jämförelse med andra tekniker. Först, med tanke på fokus märkning av celler, är en möjlighet att urskilja celler autonoma och icke-cells autonoma effekter. Det andra, genetisk manipulering med inducerbara system gör att man kan jämföra effekter före eller efter synaptisk integrering. Vidare kan man kringgå anv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från Department of Defense (idéutveckling utmärkelse, W81XWH-10-1-0041, AB), CT stamceller bidrag (AB), och en National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF). Den nuvarande Materialet baseras på arbete delvis stöds av staten Connecticut under Connecticut stamcellsforskning Grants. Dess innehåll är helt och hållet av författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter i staten Connecticut, Institutionen för folkhälsovetenskap i delstaten Connecticut eller CT Innovations hade Inc. finansiärer ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
Referências
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neurociência. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
