Хромосома Подготовка из культивируемых клеток
Summary
Хромосомы могут быть выделены из живых клеток, таких как лимфоциты или фибробластами кожи, и из организмов, включая человека или мышей. Эти препараты хромосом могут быть дополнительно использованы для рутинного G-диапазонов и молекулярных цитогенетических процедур, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и спектральной кариотипирование (SKY).
Abstract
Хромосомный анализ (цитогенетический) широко используется для обнаружения хромосомной нестабильности. При последующей G-диапазонов и молекулярных методов, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), этот анализ имеет мощную способность анализировать отдельные ячейки для аберраций, которые включают доходы или потери части генома и перестроек с участием одного или нескольких хромосом. У людей, хромосомные отклонения происходят в примерно 1 на 160 живорожденных 1,2, 60-80% всех выкидышей 3,4, 10% мертворождений 2,5, 13% людей с врожденным пороком сердца 6, 3-6% случаев бесплодия 2, и у многих пациентов с задержкой развития и врожденных дефектов 7. Цитогенетический анализ злокачественности обычно используется исследователями и врачами, как наблюдения клоновых хромосомных аномалий, как было показано, чтобы иметь как диагностическую, так и прогностическую значимость 8,9.60; изоляция Хромосома имеет неоценимое значение для генной терапии и стволовых клеток исследования организмов, включая приматов и грызунов 10-13.
Хромосомы, могут быть выделены из клеток живых тканей, в том числе лимфоцитов крови, фибробласты кожи, amniocytes, плаценты, костный мозг, и образцов опухоли. Хромосомы проанализированы на стадии метафазы митоза, когда они больше всего конденсируется и, следовательно, более четко видны. Первым шагом в технике изоляции хромосома включает разрушение шпинделя волокон путем инкубации с Colcemid, чтобы предотвратить клетки от переходить к следующей стадии анафазе. Затем клетки обрабатывали гипотонического раствора и сохраняется в набухшем состоянии с фиксатором Карнуа. Затем клетки сбрасываются на слайдах и затем может быть использован для различных процедур. G-полосы включает обработку трипсином с последующим окрашиванием Гимза создать характерный светлых и темных полос. То же прocedure изолировать хромосом могут быть использованы для подготовки клеток для процедур, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) и спектральной кариотипирование (небо) 14,15.
Introduction
Хромосомный анализ представляет собой обычный метод используется во всем мире для диагностики хромосомной нестабильности и перестройки, приводящие к генетическим нарушениям и злокачественностью 1,2,8,9. Кроме того, более высокое разрешение для диагностики и исследования конституционных и рак приобрела генетических аномалий может быть достигнуто с помощью комбинации классических цитогенетических процедур и молекулярных цитогенетических методик, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH), сравнительной геномной гибридизации (CGH) , и спектральный кариотипирование (SKY) 14,15. В последнее время эти методы были использованы для оценки хромосомной нестабильности, связанной с исследований стволовых клеток. Кариотипической аномалии, такие как анеуплоидия долгосрочных культивируемых эмбриональных клеток (ES) и взрослых стволовых клеток различных организмов, сообщили нескольких лабораториях. Последние данные подтверждают, что некоторые клеточные линии по своей природе более склонны хромосом instabiLITY независимо от условий культивирования. По этой причине, при установлении и / или поддержания человека, мыши или резус линий стволовых клеток, хромосомный анализ рекомендуется как часть процесса контроля качества. Многие доклады описывают все больший интерес к использованию обычных и молекулярной цитогенетики для мониторинга хромосомной стабильности стволовых клеток и злокачественных клеток или различных организмов в культуре 10-13. Эти протоколы чаще используется негенетических лабораторий для экспресс-оценки хромосомной их культивируемых клеток 13. Мы представляем наши основные процедуры по подготовке хромосом из различных типов клеток, которые могут быть применены для клинических и исследовательских целей и клеток, полученных из различных организмов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы использовали существующую процедуру для изоляции хромосом из клеток различных организмов, в том числе различные типы клеток, полученных из человеческих, макак-резус, крыс и мышей 11,20-22. Стандартный протокол обеспечен, но некоторые ключевые этапы и переменные, возможно, должны ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа описано в этой рукописи стало возможным благодаря финансированию Фонда Патрик Ф. Тейлора.
Materials
| KaryoMAX Colcemid | Gibco | 15212-012 | |
| HBSS Buffer | Gibco | 24020-117 | |
| 0.5% Trypsin EDTA 10x | Gibco | 15400-054 | |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| Buffer Tablets "GURR" | Gibco | 10580-013 | |
| Geimsa Stain | Ricca Chemical Company | 3250-16 | |
| Centrifuge 5810 | Eppendorf | ||
| Methanol | Caledon Laboratory Chemicals | 6700130 | |
| Glacial Acetic Acid | Krackeler Scientific Inc. | 11-9508-05 |
Referências
- Driscoll, D., Gross, S. Prenatal screening for aneuploidy. New Engl. J. Med. 360, 2556-2562 (2009).
- Nussbuam, R., et al. . Genetics in Medicine: 7th Edition. , 76 (2007).
- Ljunger, E., et al. Chromosomal abnormalities in first-trimester miscarriages. Acta Obstet. Gynecol. Scand. 84 (11), 1103-1107 (2005).
- Kwinecka-Dmitri, B., et al. Frequency of chromosomal aberrations in material from abortions. Ginecol. Pol. 81 (12), 896-901 (2010).
- Reddy, U., et al. Stillbirth classification—Developing an international consensus for research: Executive summary of a national institute of child health and human development workshop. Obstet. Gynecol. 114 (4), 901-914 (2009).
- Pierpoint, M., et al. Genetic basis for congenital heart defects: Current knowledge. Circulation. 115 (23), 3015 (2007).
- Kaneshiro, N., Zieve, D. Down Syndrome: Trisomy 21.. PubMed Health. , (2010).
- Cin, P. D. . Current Protocols in Human Genetics. , (2003).
- Wang, N. Methodologies in cancer cytogenetics and molecular cytogenetics. Am. J. Med. Genet. 115 (3), 118-124 (2002).
- Miura, M., et al. Accumulated Chromosomal Instability in Murine Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Leads to Malignant Transformation. Stem Cells. 24 (4), 1095-1103 (2006).
- Izadpanah, R., et al. Long-term In vitro Expansion Alters the Biology of Adult Mesenchymal Stem Cells. Cancer Res. 68 (11), 4229-4238 (2008).
- Dekel-Naftali, M., et al. Screening of human pluripotent stem cells using CGH and FISH reveals low-grade mosaic aneuploidy and a recurrent amplification of chromosome 1q. Eur. J. Hum. Genet. 20 (12), 1248-1255 (2012).
- Moralli, D., Yusuf, M., Mandegar, M., Khoja, S., Monaco, Z. L., Volpi, E. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and iPS Cells. Stem Cell Rev. Rep. 7 (2), 471-477 (2011).
- Bayani, J., Squire, J. Traditional banding of chromosomes for cytogenetic analysis. Curr. Protoc. Cell Biol. 22, (2004).
- Speicher, M. R., Carter, N. P. The new cytogenetics: blurring the boundaries with molecular biology. Nat. Rev. Genet. 6 (10), 782-792 (2005).
- Benn, P., Delach, J. Human Lymphocyte Culture and Chromosome Analysis. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Muul, L. M., Heine, G., Silvin, C., James, S. P., Candotti, F., Radbruch, A., Worm, M. . Measurement of Proliferative Responses of Cultured Lymphocytes, Curr. Protoc. Immunol. , (2011).
- Barch, M. J., Knutsen, T., Spurbeck, J. . The Association of Genetic Technologists Cytogenetics Laboratory Manual. San Francisco: 3rd edition. , (1997).
- Dewald, G. W., Ketterling, R. P., Wyatt, W. A., Stupca, P. J., McClatchey, K. D. Cytogenetic studies in neoplastic hematologic disorders. In Clinical Laboratory Medicine, 2nd edition. , 658-685 (2002).
- Kibe, R., et al. IL-7Rα deficiency in p53(null) mice exacerbates thymocyte telomere erosion and lymphomagenesis. Cell Death Different. 19 (7), 1139-1151 (2012).
- Tsien, F., Morava, E., Talarski, A., Marble, M. Phenotypic features of a boy with trisomy of 16q22–>qter due to paternal Y; 16 translocation. Clin. Dysmorphol. 4 (4), 177-181 (2005).
- Tsien, F., et al. Prolonged culture of normal chorionic villus cells yields ICF syndrome-like chromatin decondensation and rearrangements. Cytogenet. Genome Res. 8 (1), 13-21 (2002).
- McGrattan, P., Campbell, S., Cuthbert, R., Jones, F., McMullin, M., Humphreys, M. Integration of conventional cytogenetics (G-banding), comparative genomic hybridization (CGH) and interphase fluorescence in situ hybridization (i-FISH) for the detection of genomic rearrangements in acute leukemia. J. Clin. Pathol. 61 (8), 903-908 (2008).
