Bireysel Renal Hücreli Kanserlerde içinde Protein Ekspresyonu Varyasyon kaynakları için Ters Faz Protein Diziler (RPPA) ve Kullanımı
Summary
RPPA floresan etiketli antikorlar kullanılarak, aynı anda sorgulanmak üzere nitroselüloz slaytlar basılı örnekleri yüzlerce, protein ekspresyonu sağlar. Bu teknik, şeffaf hücreli böbrek karsinomu olan ilaç tedavisi heterojenliğin etkisini araştırmak için uygulanmıştır.
Abstract
Bulunduğu metastatik şeffaf hücreli renal hücreli kanser için hiçbir iyileştirici tedavi, hastalığın yaygın varyantı vardır. Bu tedaviye direnç önemli bir faktör hastalığı 1 moleküler karmaşıklığı olduğu düşünülmektedir. Gibi tirozin kinaz inhibitörü (TKİ)-sunitinib olarak Hedefli tedavi kullanılmıştır, ancak hastaların sadece% 40 1 yıl 2 içinde relaps bu hastaların büyük çoğunluğu ile cevap verecektir. Renal hücreli kanser hastalarında içsel ve kazanılmış direnç gibi soru 3 derece alakalı olduğu gibi.
Etkili, kişiselleştirilmiş tedavilerin geliştirilmesi nihai hedefi ile, TKI direnç incelemek için, hedeflenmiş tedavinin belirli bir süre sonra sıralı dokusu, kronik myeloid lösemi 4 başarılı olduğunu kanıtlamıştı bir yaklaşım gereklidir. Ancak renal hücreli karsinom, böyle bir stratejinin uygulama b yüksek düzeyde nedeniyle karmaşıklaşırrenal hücre karsinomu 5,6 yanı sıra diğer katı tümörler içinde bir 7 özelliği oth arası ve intratumoral heterojen. Transkriptomik ve genetik farklılıklar nedeniyle Intertumoral heterojenite iyi bile benzer sunum, evre ve tümör derecesi olan hastalarda kurulmuştur. Buna ek olarak daha büyük moleküler heterojenite temsil etmek olasıdır BİK büyük morfolojik (intratümöral) heterojenite, var olduğu açıktır. Kombine morfolojik analiz ve Fuhrman derecelendirme ile BİK tümörlerin detaylı haritalama ve kategorizasyon proteomik analiz için temsili alanların seçimini sağlar.
BİK 8 Protein temelli analiz nedeniyle patoloji laboratuvarlarında yaygın durumuna cazip olmakla birlikte, uygulama spesifik antikorlar 9 sınırlı durumu nedeniyle sorunlu olabilir. Ters Faz Protein Dizilerin dot blot doğa (RPPA), antikor zorunluluktur Borçlar be ön doğrulanmış; kullanılan antikorların böyle sıkı kalite kontrol olarak büyük önem taşımaktadır. Bu kısıtlamaya rağmen dot blot biçimi tek bir nitroselüloz slayda örnekleri yüzlerce baskı sağlayan, tahlil minyatür izin vermiyor. Baskılı slaytlar sonra çoğullama sağlayan, hedefe özgü primer antikor ve fluoresan etiketli ikincil antikoru kullanılarak Batı analizi ile benzer bir şekilde analiz edilebilir. Slayttaki tüm örneklerin genelinde Diferansiyel protein ekspresyonu sonra bir daha maliyet-etkin ve yüksek-throughput şekilde floresans göreli düzeyi karşılaştırılarak aynı anda analiz edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan RPPA yöntemi protein analizleri yaygın olarak kullanılan ancak nispeten düşük verim western blot için yüksek kapasiteli bir alternatif temsil eder. Yöntem örnekleri yüzlerce analiz edilmiş ve aynı anda hücre hatları ve doku örnekleri geniş bir yelpazede yer alan önemli proteinlerinin doğrudan karşılaştırma için izin karşılaştırıldığında yarı kantitatif olmasına imkan verir. Farklı antikor türleri ile Multiplexing daha çok antikor aynı anda kullanılmasına izin tekni?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ETM37 ve Birleşik Krallık Kanser Araştırma Deneysel Kanser Tıp Merkezi tarafından desteklenen: Baş Bilim Ofisi, hibe sayısına göre finanse edilmektedir Yukarıdaki yazarların FCO, DF, JN, DJH ve GDS çalışması bahsettiniz. AL çalışmaları Edinburgh Robertson Güven, bakım ve kanser ve Tıbbi Araştırma Konseyi tedavi için Melville Trust Cerrahlar Kraliyet Koleji tarafından finanse edilmektedir. IO Marie Curie Eylemleri ve İngiltere'de Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından cofunded Edinburgh İskoç Hükümeti Bursu Royal Society tarafından desteklenmektedir. Yazarlar bu çalışmada tartışılan konulardan bazıları üzerinde yararlı tartışmalar için SCOTRRCC ortak başvuru ve işbirlikçileri teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| aprotinin | Sigma | A6279 |
| phosphatase inhibitor cocktail 2 | Sigma | P5726 |
| phosphatase inhibitor cocktail 3 | Sigma | P0044 |
| protease inhibitor cocktail | Roche | 11836153001 |
| Triton X-100 | Triton-X | T8787 |
| Li-Cor Odyssey Blocking Buffer | Li-Cor | 927-40000 |
| TissueLyser | Qiagen | 85600 |
| MicroGrid II robotic spotter | Biorobotics | |
| FastFrame’ four bay slide holder | Whatman | 10486001 |
| FAST Slide – 2-Pad | Whatman | 10485317 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | Licor | 926-68020 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | Licor | 926-32211 |
Referências
- Stewart, G. D., O’Mahony, F. C., Powles, T., Riddick, A. C., Harrison, D. J., et al. What can molecular pathology contribute to the management of renal cell carcinoma. Nat. Rev. Urol. 8, 255-265 (2011).
- Rini, B. I., Michaelson, M. D., Rosenberg, J. E., Bukowski, R. M., Sosman, J. A., et al. Antitumor activity and biomarker analysis of sunitinib in patients with bevacizumab-refractory metastatic renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. 26, 3743-3748 (2008).
- Swanton, C., Larkin, J. M., Gerlinger, M., Eklund, A. C., Howell, M., et al. Predictive biomarker discovery through the parallel integration of clinical trial and functional genomics datasets. Genome Med. 2, 52 (2010).
- Cortes, J., Jabbour, E., Kantarjian, H., Yin, C. C., Shan, J., et al. Dynamics of BCR-ABL kinase domain mutations in chronic myeloid leukemia after sequential treatment with multiple tyrosine kinase inhibitors. Blood. 110, 4005-4011 (2007).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., Horswell, S., Larkin, J., Endesfelder, D., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. 366, 883-892 (2012).
- Fisher, R., Larkin, J., Swanton, C. Inter and intratumour heterogeneity: a barrier to individualized medical therapy in renal cell carcinoma. Front. Oncol. 2, 49 (2012).
- Yachida, S., Jones, S., Bozic, I., Antal, T., Leary, R., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467, 1114-1117 (2010).
- O’Mahony, F. C., Faratian, D., Varley, J., Nanda, J., Theodoulou, M., et al. The use of automated quantitative analysis to evaluate epithelial-to-mesenchymal transition associated proteins in clear cell renal cell carcinoma. PLoS One. 7, e31557 (2012).
- Spurrier, B., Ramalingam, S., Nishizuka, S. Reverse-phase protein lysate microarrays for cell signaling analysis. Nat. Protoc. 3, 1796-1808 (2008).
- Hu, J., He, X., Baggerly, K. A., Coombes, K. R., Hennessy, B. T., et al. Non-parametric quantification of protein lysate arrays. Bioinformatics. 23, 1986-1994 (2007).
- Wang, X., Dong, Y., Jiwani, A. J., Zou, Y., Pastor, J., et al. Improved protein arrays for quantitative systems analysis of the dynamics of signaling pathway interactions. Proteome Sci. 9, 53 (2011).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological). 57, 289-300 (1995).
