De<em> Citrobacter rodentium</em> Muis Model: Studeren pathogeen en gastheer Bijdragen aan infectieuze colitis
Summary
Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.
Abstract
Dit protocol beschrijft de stappen om een robuust model van infectieziekten en colitis produceren, evenals de methoden om Citrobacter rodentium infectie in muizen karakteriseren. C. rodentium is een gram-negatieve murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de klinisch belangrijke humane pathogenen enteropathogene E. coli en enterohemorragische E. coli. Na infectie met C. rodentium, immunocompetente muizen last van bescheiden en van voorbijgaande aard gewichtsverlies en diarree. Histologisch, worden intestinale crypte rek, immuun cel infiltratie en goblet cel depletie waargenomen. Klaring van infectie wordt bereikt na 3 tot 4 weken. Meting van intestinale epitheliale barrière integriteit bacteriologische belasting en histologische schade op verschillende tijdstippen na infectie, kan de karakterisering van muizenstammen gevoelig voor infectie.
De virulentiemechanismes waardoor bacteriële pathogenen koloniseren de darm van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties worden slecht begrepen. Daarom C. rodentium model van enterische bacteriële infectie dient als een waardevol instrument om te helpen in ons begrip van deze processen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische inflammatoire reacties die bij IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen na abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën. Daarom is de studie van modellen van infectieuze colitis biedt aanzienlijke mogelijkheden voor het definiëren van potentieel pathogene gastheer responsen tegen darmbacteriën. C. rodentium geïnduceerde colitis is een dergelijke zeldzame model waarmee voor de analyse van gastheer responsen tegen darmbacteriën, bevordering van ons inzicht in potentiële mechanismen van IBD pathogenese;essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen.
Introduction
Enterische infectie door bacteriële pathogenen triggers gastro-intestinale (GI) ontsteking en intestinale pathologie en pathofysiologie, waaronder diarree en intestinale epitheliale barrière disfunctie. De virulentie mechanismen waardoor bacteriële pathogenen koloniseren het maagdarmkanaal van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties slecht begrepen, hebben echter recente ontwikkelingen in de modellering van enterische bacteriële infecties begonnen ons begrip van deze processen ondersteunen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). De IBDs Crohn's Disease (CD) en UC complexe ziekten van onbekende etiologie die wordt gekenmerkt door chronische darmontsteking en weefselschade. Veel muismodellen van darmontstekingen bestaan van spontane ontsteking in genetisch gemodificeerde stammen, zoals IL10 – / – muizen, chemische problemen met verbindingen, zoals natriumsulfaat dextran (DSS) en dinitrobenzene sulfonzuur (DNBS) 1. Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische ontstekingsreacties in IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen op abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën 2, dus de studie van modellen van colitis infectieuze ook een groot potentieel voor het definiëren van potentieel pathogene ontvangende . reacties op darmbacteriën Citrobacter rodentium geïnduceerde colitis is een van de zeldzame modellen van colitis infectieuze dat goed is gekarakteriseerd 1,3, waardoor de analyse van gastheer responsen tegen enterische bacteriën en verder begrip van mogelijke mechanismen van IBD pathogenese, een essentiële stap in de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen.
C. rodentium is een gram-negatieve bevestiging en uitwissen (A / E), murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de belangrijke menselijkepathogenen enteropathogene E. coli (EPEC) en enterohemorragische E. coli (EHEC) 3-8. De familie van A / E pathogenen nauw hechten aan het apicale membraan van gastheercel en de cecal colonepitheel, die een niet-invasieve voetstuk-achtige structuur van de gastheercel. Orale uitdaging met C. rodentium van 10 8 -10 9 organismen produceert een robuust model van infectieuze colitis gekenmerkt door dikke hyperplasie of verlenging van de crypten, mononucleaire immuuncellen infiltratie en goblet cel depletie 3,4. De eerste site van kolonisatie, een paar uur na uitdaging is bovenaan cecal patch, gevolgd door overgang naar het distale colon 2 tot 3 dagen na infectie 3. In immunocompetente muizenstammen wordt klaring van het pathogeen bereikt 3 tot 4 weken na infectie 1,3,4. Echter veel genetisch gemodificeerde stammen, namelijk gen deficiënte of knockout (- / -) muizen zijn, bleken increa weersed vatbaarheid voor infecties resulteert in overdreven schade en / of chronische infecties en ontstekingen 9-14. Het gebruik van deze infectieuze colitis model in deze knock-out stammen, veel ontbreekt aangeboren signaleringeiwitten, is onmisbaar in het onthullen van een aantal gastheereiwitten integraal naar de resolutie van de intestinale infecties en ontstekingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium infectie een waardevol model voor de studie van zowel infectieziekten en colitis bij muizen. Dit unieke model maakt de karakterisering van zowel gastheer reacties en de pathogene eigenschappen van bacteriën. De stappen die in dit protocol detail het succesvolle gebruik van dit model.
Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol in gedachten te houden bij het opwekken van colitis en het analyseren van reacties. Enerzijds de bereiding van een verse ov…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies aan BAV van de Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC) en de Canadese Instituten for Health Research (CIHR). NL werd gefinancierd door een gediplomeerde studententijd van CIHR. BAV is het kinder met darm-en leveraandoeningen (KIND) Stichting Leerstoel Pediatric IBD Research en de Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
Referências
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
