Die<em> Citrobacter rodentium</em> Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis
Summary
Citrobacter rodentium Infektion bietet ein wertvolles Modell zur enteralen bakterielle Infektionen zu untersuchen sowie Host Immunantwort und Kolitis bei Mäusen. Dieses Protokoll beschreibt die Messung der Barriere Integrität, pathogenen Belastung und histologische Beschädigung, die eine für die gründliche Charakterisierung von Erreger und Wirt Beiträge murine infektiöse Kolitis.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um ein robustes Modell von Infektionskrankheiten und Colitis zu produzieren, sowie die Methoden zur Citrobacter rodentium Infektion in Mäusen zu charakterisieren. C. rodentium ist ein gram-negative, murine bestimmte bakterielle Erreger, die eng mit der klinisch wichtige menschliche Krankheitserreger enteropathogenen E. verwandt ist coli und enterohämorrhagischen E. coli. Nach Infektion mit C. rodentium, immunkompetenten Mäusen leiden bescheiden und vorübergehende Gewichtsverlust und Durchfall. Histologisch sind Darm-crypt Dehnung, Immun-Zell-Infiltration und Becherzellen Zell-Depletion beobachtet. Clearance der Infektion wird nach 3 bis 4 Wochen erreicht. Messung der intestinalen Epithelbarriere Integrität, bakterielle Belastung und histologische Schäden zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infektion, erlauben die Charakterisierung von Mausstämmen anfällig für Infektionen.
Die Virulenz Mechanismuss mit dem bakteriellen Erreger besiedeln den Darm ihrer Wirte sowie bestimmten Host Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen sind weitgehend unverstanden. Deshalb ist die C. rodentium Modell enterischen bakterielle Infektion dient als wertvolles Werkzeug, um unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Es wurde vermutet, dass die maladaptive chronischen Entzündungsreaktionen bei CED-Patienten gesehen, bei genetisch anfälligen Personen nach abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Darmbakterien zu entwickeln. Daher bietet die Studie von Modellen von infektiöse Kolitis erhebliches Potential zur Definition potentiell pathogenen Host Reaktionen auf Enterobakterien. C. rodentium induzierte Colitis ist eine solche seltenen Modell, das für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien ermöglicht,, das Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese;essentiell für die Entwicklung von neuartigen präventiven und therapeutischen Behandlungen.
Introduction
Infektion durch enterale bakterielle Erreger löst gastrointestinale (GI) Entzündungen sowie Darm-Pathologie und Pathophysiologie, einschließlich Durchfall und Darm-epitheliale Barriere Dysfunktion. Die Virulenz Mechanismen, durch die bakteriellen Erreger besiedeln den GI-Trakt der Gastgeber, sowie spezielle Host-Reaktionen, die gegen solche Infektionen zu verteidigen schlecht verstanden werden, haben jedoch Fortschritte in der Modellierung von enterischen bakterielle Infektionen begonnen, unser Verständnis dieser Prozesse zu unterstützen. Darmbakterien haben auch zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) in Verbindung gebracht worden. Die IBDs Morbus Crohn (CD) und UC sind komplexe Erkrankungen unbekannter Ätiologie, die durch chronische Darm-Entzündung und Gewebeschädigung gekennzeichnet. Viele Mausmodellen Darmentzündung existieren, durch spontane Entzündung in genetisch modifizierten Stämme wie IL10 – / – Mäuse, um chemische Herausforderungen mit Verbindungen, wie Dextran Natriumsulfat (DSS) und dinitrobenzene sulfonsäure (DNBS) 1. Es wurde vermutet, dass die Fehlanpassung chronischen Entzündungsreaktionen in IBD-Patienten bei genetisch vorbelasteten Individuen entwickeln bei einem abnormalen Belastung der Darmschleimhaut Immunsystem Enterobakterien 2, also in der Studie von Modellen von infektiöse Kolitis auch signifikante Möglichkeit der Festlegung von potentiell pathogenen Host . Reaktionen auf Enterobakterien Citrobacter rodentium induzierte Colitis ist eines der seltenen Modelle infektiöse Kolitis, aber gut 1,3 dadurch, so dass für die Analyse der Host Reaktionen auf Enterobakterien und weiteres Verständnis der Mechanismen der potentiellen IBD Pathogenese; ein wesentlicher Schritt bei der Entwicklung neuartiger präventiven und therapeutischen Behandlungen.
C. rodentium ist ein Anbringen und gramnegative Effacing (A / E), Murines spezifischen bakterielles Pathogen, das eng mit dem wichtigen menschlichen zusammenhängtPathogene enteropathogenen E. coli (EPEC) und enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) 3-8. Die Familie von A / E Pathogene innig an die apikale Wirtszellmembran der Blinddarm und Kolonepithel befestigen, Bilden einer nicht-invasiven sockelartigen Struktur auf der Wirtszelle. Oral Herausforderung mit C. rodentium von 10 8 -10 9 Organismen produziert eine robuste Ausführung der infektiöse Kolitis durch die mikrobielle Hyperplasie oder Dehnung der Krypten, einkernigen Immunzelle Infiltration und Becherzellen Zelldepletion 3,4 charakterisiert. Der Ort der ersten Besiedlung, ein paar Stunden nach Herausforderung, an der Blinddarm Patch, gefolgt von Progression zu distalen Kolon 2 bis 3 Tage nach der Infektion 3. Bei immunkompetenten Maus-Stämmen ist Clearance des Erregers 3 bis 4 Wochen nach der Infektion 1,3,4 erreicht. Allerdings sind viele genetisch veränderte Stämme, zB Gen defizient oder Knockout-(- / -)-Mäusen wurden, gefunden worden, um anzuzeigen Increased Infektionsanfälligkeit was zu Schäden übertrieben und / oder chronischen Infektion und Entzündung 9-14. Mit der Benutzung dieser infektiöse Kolitis Modell in dieser Knockout-Stämme, viele fehlen angeborenen Signalproteine, wurde bei der Aufdeckung mehrerer Wirtsproteinen integraler Bestandteil Auflösung von Darm-Infektion und Entzündung unverzichtbar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium Infektion stellt ein geeignetes Modell für die Untersuchung von sowohl infektiösen Krankheit und Colitis bei Mäusen. Diese einzigartige Modell erlaubt die Charakterisierung von Host Reaktionen sowie der pathogenen Eigenschaften der Bakterien. Die beschriebenen Schritte in diesem Protokoll detailliert die erfolgreiche Anwendung dieses Modells.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in diesem Protokoll im Auge zu behalten, wenn induzieren ulcerosa und Analyse Antwo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Betriebskostenzuschüsse für BAV von der Morbus Crohn und Colitis Foundation of Canada (CCFC) und der Canadian Institutes for Health Research (CIHR) unterstützt. GB wurde von einem Diplom-Stipendium aus CIHR finanziert. BAV ist die Kinder mit Darm-und Leber-Erkrankungen (CHILD) Foundation Chair of Pediatric IBD Forschung und Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
Referências
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
