Den<em> Citrobacter rodentium</em> Mus Modell: Studerer patogen og Host Bidrag til infeksiøs kolitt
Summary
Citrobacter rodentium infeksjon gir en verdifull modell for å studere enteriske bakterielle infeksjoner samt vert immunresponser og kolitt hos mus. Denne protokollen beskriver måling av barriere integritet, patogen last og histologiske skader som åpner for grundig karakterisering av patogene og vert bidrag til murine smittsomme kolitt.
Abstract
Denne protokollen skisserer trinnene som kreves for å produsere en robust modell av infeksjonssykdom og kolitt, samt de metoder som benyttes for å karakterisere citrobacter rodentium infeksjon hos mus. C. rodentium er en gram negativ, murine spesifikk bakteriell patogen som er nært knyttet til klinisk viktige menneskelige patogener enteropatogene E. coli og enterohemorrhagic E. coli. Ved infeksjon med C. rodentium, immunkompetente mus lider beskjeden og forbigående vekttap og diaré. Histologisk, er intestinal krypten forlengelse, immunceller infiltrasjon og pokal celle uttømming observert. Clearance av infeksjon oppnås etter 3 til 4 uker. Måling av tarmepitel barriere integritet, bakteriell last, og histologiske skader ved ulike tidspunkt etter infeksjonen, tillate karakterisering av muselinjer mottakelig for infeksjon.
Virulens mekanismes der bakterielle patogener kolonisere tarmkanalen av sine verter, samt spesifikke vert respons som beskytter mot slike infeksjoner er dårlig forstått. Derfor C. rodentium modell av enterisk bakterieinfeksjon fungerer som et verdifullt verktøy for å hjelpe i vår forståelse av disse prosessene. Enteriske bakterier har også vært knyttet til inflammatoriske tarmsykdommer (IBDs). Det har blitt antatt at disse maladaptive kroniske inflammatoriske responser sett i IBD pasienter utvikle seg i genetisk disponerte individer etter unormal eksponering av intestinal mucosal immunsystem til enteriske bakterier. Derfor tilbyr studiet av modeller av infeksiøs kolitt betydelig potensial for å definere potensielt patogene vert svar på enteriske bakterier. C. rodentium indusert kolitt er en slik sjelden modell som tillater analyse av verten responser til enteriske bakterier, fremme vår forståelse av potensielle mekanismer IBD patogenesen;vesentlig i utviklingen av nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.
Introduction
Infeksjon av enteriske bakterielle patogener utløser gastrointestinale (GI) betennelse, samt intestinal patologi og patofysiologi, inkludert diaré og tarmepitel barriere dysfunksjon. Virulens mekanismer som bakterielle patogener kolonisere mage-tarmkanalen av sine verter, samt spesifikke vert respons som beskytter mot slike infeksjoner er dårlig forstått, har imidlertid de siste fremskritt i modellering av enteriske bakterielle infeksjoner begynt å hjelpe vår forståelse av disse prosessene. Enteriske bakterier har også vært knyttet til inflammatoriske tarmsykdommer (IBDs). Den IBDs Crohns sykdom (CD) og UC er komplekse sykdommer av ukjent etiologi, karakterisert av kronisk tarmbetennelse og vevsskade. Mange musemodeller av tarmbetennelse eksisterer, fra spontan betennelse i genmodifiserte stammer, for eksempel IL10 – / – mus, til kjemiske utfordringer med forbindelser, såsom dekstran natriumsulfat (DSS) og dinitrobenzene sulfonsyre (DNBS) 1. Det har blitt antatt at disse maladaptive kroniske inflammatoriske responser til stede i IBD pasienter utvikler seg i genetisk disponerte individer ved unormal eksponering av intestinal mucosal immunsystem til enteriske bakterier 2, derfor studiet av modeller av infeksiøs kolitt tilbyr også et betydelig potensial for å definere potensielt sykdomsfremkallende vert . Responsen på enteriske bakterier citrobacter rodentium indusert kolitt er en av de sjeldne modeller av infeksiøs kolitt som har blitt godt karakterisert 1,3, slik at for analyse av verten responser på enteriske bakterier og videre forståelse av potensielle mekanismer IBD patogenesen, en avgjørende skritt i å utvikle nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.
C. rodentium er en gram negativ feste og effacing (A / E), murine spesifikk bakteriell patogen som er nært knyttet til viktige menneskeligepatogener enteropatogene E. coli (EPEC) og enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) 3-8. Familien av A / E patogener intimt feste til den apikale vertscelle membran av cecal og colonic epitel, danner en ikke-invasiv pidestall-lignende struktur på vertscellen. Oral utfordring med C. rodentium av 10 8 -10 9 organismer produserer en robust modell av infeksiøs kolitt preget av colonic hyperplasi eller forlengelse av crypts, mononukleære immunceller infiltrasjon og pokal celle utarming 3,4. Den innledende stedet kolonisering, et par timer etter utfordring, er på cecal lapp, etterfulgt av progresjon til distale colon 2-3 dager etter smitte 3. I immunkompetente musestammer, er clearance av organismen oppnådd 3 til 4 uker etter smitte 1,3,4. Men mange genmodifiserte stammer, dvs. genet mangelfull eller knockout (- / -), er mus, blitt funnet å vise øktsed mottakelighet for infeksjon resulterer i overdreven skade og / eller kronisk infeksjon og betennelse 9-14. Bruk av denne smittsomme kolitt modell i disse knockout stammer, mange mangler medfødte signal proteiner, har vært uunnværlig i å avsløre flere vert proteiner integrert i oppløsning på intestinal infeksjon og betennelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium infeksjon gir en verdifull modell for studiet av både smittsomme sykdommer og kolitt i mus. Denne unike modellen tillater for karakterisering av både vert responser, samt patogene egenskaper av bakterier. Fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen detalj vellykket bruk av denne modellen.
Det er flere kritiske trinnene i denne protokollen å huske på når du induserer kolitt og analysere svarene. Først, utarbeidelse av en frisk over natten C. r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd til BAV fra Crohns og kolitt Foundation of Canada (CCFC) og den kanadiske Institutes for Health Research (CIHR). GB ble finansiert av en utdannet studieplass fra CIHR. BAV er barna med Intestinal og leversykdommer (barn) Foundation Chair of Pediatric IBD Forskning og Canada Research Chair i Pediatric Gastroenterology.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
Referências
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
