Den<em> Citrobacter rodentium</em> Mus Modell: Studera patogen och värd Bidrag till infektiös kolit
Summary
Citrobacter rodentium infektion ger en värdefull modell för att studera enteriska bakterieinfektioner samt värd immunsvar och kolit hos möss. Detta protokoll beskriver mätning av barriären integritet, patogener belastning och histologisk skada som möjliggör en grundlig karaktärisering av patogen och värd bidrag till murin smittsam kolit.
Abstract
Detta protokoll beskriver de steg som krävs för att producera en robust modell för infektionssjukdomar och kolit samt de metoder som används för att karakterisera Citrobacter rodentium infektion hos möss. C. rodentium är en gramnegativ, mus specifik bakteriell patogen som är nära relaterad till kliniskt viktig mänsklig patogener enteropatogen E. coli och enterohemorragisk E. coli. Vid infektion med C. rodentium, immunkompetenta möss lider blygsam och övergående viktminskning och diarré. Histologiskt är intestinala krypta töjning, immunceller infiltration och bägare cellbristen observeras. Clearance av infektion uppnås efter 3 till 4 veckor. Mätning av intestinal epitelial barriär integritet, bakteriell belastning, och histologisk skada vid olika tidpunkter efter infektion, tillåta karakterisering av musstammar som är mottagliga för infektion.
Virulensen Mekanismens genom vilken bakteriella patogener kolonisera tarmkanalen hos sina värdar, liksom specifika svar värd som försvarar mot sådana infektioner är dåligt förstådd. Därför C. rodentium modell av enterisk bakterieinfektion fungerar som ett värdefullt verktyg för att underlätta förståelsen av dessa processer. Tarmbakterier har också kopplats till inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs). Det har antagits att de maladaptiva kroniska inflammatoriska svar som ses i IBD-patienter utvecklas i genetiskt mottagliga individer efter onormal exponering av det intestinala mukosala immunsystemet tarmbakterier. Därför erbjuder studiet av modeller för smittsamma kolit betydande potential för att definiera potentiellt svar patogena värd för tarmbakterier. C. rodentium inducerad kolit är en sådan sällsynt modell som gör det möjligt att analysera värd svar på tarmbakterier, främja vår förståelse av potentiella mekanismer för IBD patogenes,väsentlig för utvecklingen av nya förebyggande och terapeutiska behandlingar.
Introduction
Infektion av enteriska bakteriella patogener utlöser gastrointestinala (GI) inflammation, liksom intestinal patologi och patofysiologi, inklusive diarré och intestinal epitelial barriär dysfunktion. Virulens mekanismer genom vilka bakteriella patogener koloniserar mag-tarmkanalen av sina värdar, samt särskilda svar värd som försvarar mot sådana infektioner är dåligt förstådda, har dock de senaste framstegen inom modellering av enterala bakterieinfektioner börjat hjälpa vår förståelse av dessa processer. Tarmbakterier har också kopplats till inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs). Den IBDs Crohns sjukdom (CD) och UC är komplexa sjukdomar med okänd etiologi, som kännetecknas av kronisk tarminflammation och vävnadsskada. Många musmodeller av tarminflammation existerar, från spontan inflammation i genetiskt modifierade stammar, såsom IL10 – / – möss, kemiska utmaningar med föreningar, såsom dextran natriumsulfat (DSS) och dinitrobenzene sulfonsyra (DNBS) 1. Det har hypoteser om att de maladaptiva kroniska inflammatoriska reaktioner som finns i IBD-patienter utvecklas genetiskt känsliga individer vid onormal exponering av tarmens slemhinna immunsystemet tarmbakterier 2, alltså studiet av modeller för smittsamma kolit erbjuder också en betydande potential för att definiera potentiellt patogena värd . svar på tarmbakterier Citrobacter rodentium inducerad kolit är en av de sällsynta modeller av smittsam kolit som har väl karakteriserade 1,3, vilket möjliggör analys av värd svar på tarmbakterier och ytterligare förståelse av potentiella mekanismer för IBD patogenes, ett viktigt steg att utveckla nya förebyggande och terapeutiska behandlingar.
C. rodentium är en gramnegativ fästa och utplåna (A / E), mus specifik bakteriell patogen som är nära relaterad till den viktiga mänskligapatogener enteropatogen E. coli (EPEC) och Enterohemorragisk E. coli (EHEC) 3-8. Familjen av A / E patogener fäster intimt till den apikala värdcellmembranet av cekala och kolon epitel, bildar en icke-invasiv piedestal-liknande struktur på värdcellen. Oral utmaning med C. rodentium av 10 8 -10 9 organismer producerar en robust modell av smittsam kolit kännetecknas av kolon hyperplasi eller förlängning av kryptor, mononukleär immunceller infiltration och bägare cellbristen 3,4. Den initiala platsen för kolonisering, några timmar efter utmaningen, är vid den cekala plåstret, följt av progression till den distala kolon 2 till 3 dagar efter infektion 3. Hos immunkompetenta musstammar är clearance av patogenen uppnått 3 till 4 veckor efter infektion 1,3,4. Emellertid, många genetiskt modifierade stammar, dvs genen bristfällig eller knockout (- / -) möss har, befunnits visa increased mottaglighet för infektion resulterar i överdriven skada och / eller kronisk infektion och inflammation 9-14. Användning av denna smittsamma kolit modell i dessa knockout stammar, många saknar medfödda signalerande proteiner, har varit oumbärlig för att avslöja flera värdproteiner integrerad lösning av intestinal infektion och inflammation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Citrobacter rodentium infektion ger en värdefull modell för studier av både infektionssjukdomar och kolit i möss. Denna unika modell gör det möjligt att karakterisera både värd svar, liksom egenskaper patogena bakterier. Stegen som beskrivs i detta protokoll detalj framgångsrik användning av denna modell.
Det finns flera viktiga steg i detta protokoll för att tänka på när framkalla kolit och analysera svaren. Först, framställning av en färsk över natten C. rode…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av driftsbidrag till BAV från Crohns och kolit Foundation of Canada (CCFC) och den kanadensiska Institutes for Health Research (CIHR). S har finansierats av en examen utbildningsbidrag från CIHR. BAV är barnen med tarm och leversjukdomar (barn) Stiftelsen ordförande i pediatrisk IBD forskning och Kanada forskning ordförande i pediatrisk gastroenterologi.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black & Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
Referências
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
