Électrotaxie microfluidique à base d'analyse quantitative à la demande de<em> Caenorhabditis elegans</em> 'Locomotion

Summary

Procédé de micro-électro-fluidique semi-automatisé pour induire à la demande dans la locomotion<em> Caenorhabditis elegans</em> Est décrite. Cette méthode est basée sur le phénomène neurophysiologique de vers répondant à des champs électriques légers («électrotaxie") à l'intérieur des canaux microfluidiques. Microfluidique électrotaxie sert d'une technique rapide, sensible, faible coût, et évolutive pour dépister les facteurs affectant la santé neuronale.

Abstract

Les Caenorhabditis elegans nématode est un modèle polyvalent organisme pour la recherche biomédicale en raison de sa conservation de gènes et les voies liées à la maladie ainsi que sa facilité de culture. Plusieurs C. modèles de maladies elegans ont été signalés, y compris les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (PD), ce qui implique la dégénérescence des dopaminergiques (DA) des neurones ^1. Les deux transgènes et des produits chimiques neurotoxiques ont été utilisés pour induire DA neurodégénérescence et les anomalies de mouvement conséquente vers, permettant des enquêtes sur la base de la neurodégénérescence et les écrans des gènes et des composés ^2,3 neuroprotecteurs.

Écrans chez les eucaryotes inférieurs comme C. elegans fournir un moyen efficace et économique pour identifier les composés et les gènes affectant la signalisation neuronale. Écrans classiques sont généralement effectuées manuellement et marqués par inspection visuelle, par conséquent, ils sont contre-tempsuming et sujettes à des erreurs humaines. En outre, la plupart se concentrent sur l'analyse du niveau cellulaire tout en ignorant locomotion, qui est un paramètre particulièrement important pour les troubles du mouvement.

Nous avons développé un système de criblage microfluidique roman (Figure 1) qui contrôle et quantifie C. La locomotion elegans de l'aide stimuli de champ électrique à l'intérieur de microcanaux. Nous avons montré qu'un champ courant continu (CC) peut induire robuste sur demande locomotion vers la cathode ("électrotaxie") ^4. Inversion de polarité du champ entraîne le ver à inverser rapidement la direction ainsi. Nous avons également montré que les défauts dans les neurones sensoriels et d'autres dopaminergiques modifier la réponse de natation ^5. Par conséquent, des anomalies dans la signalisation neuronale peuvent être déterminées en utilisant locomotion comme une lecture. La réponse du mouvement peut être quantifiée avec précision en utilisant une gamme de paramètres tels que la vitesse de nage, le corps fréquence de flexion et temps d'inversion.

<p class = "jove_content"> Notre travail a révélé que la réponse electrotactic varie avec l'âge. Plus précisément, les jeunes adultes répondent à une gamme inférieure des champs électriques et se déplacent plus rapidement par rapport aux larves ^4. Ces résultats nous ont amenés à concevoir un nouveau dispositif microfluidique pour trier passivement vers l'âge et le phénotype ^6.

Nous avons également testé la réponse des vers à impulsions DC et courant alternatif champs électriques (AC). Champs continus pulsés de différents cycles efficacement électrotaxie générés à la fois C. elegans et sa cousine C. briggsae ^7. Dans une autre expérience, symétriques champs AC avec des fréquences allant de 1 Hz à 3 kHz immobilisés vers l'intérieur du canal ^8.

Mise en oeuvre du champ électrique dans un environnement microfluidique permet une exécution rapide et automatique du dosage électrotaxie. Cette approche promet de faciliter les écrans génétiques et chimiques à haut débit pour les facteursaffectant la fonction neuronale et la viabilité.

Protocol

1. Photolithographie pour Mold Maître Fabrication Baigner un 3 pouces plaquette de silicium dans de l'acétone pendant 30 sec, puis le méthanol pendant 30 sec. Rincer avec dH 2 0 eau pendant 5 min. Sécher la surface de la plaquette avec un pistolet à air de N2. Chauffer la tranche sur une plaque chauffante à 140 ° C pendant 2 min. Plasma oxyder la surface de la tranche de silicium (1 min, 50 W). Spin-coat surface de la plaquette avec 3 ml SU-8 100 photosensib…

Representative Results

Une vidéo représentant des électrotaxie d'un type sauvage jeune adulte nématodes et de sa position et sorties de la vitesse du logiciel de suivi du ver sont présentés dans la vidéo supplémentaire 1 et la Figure 3. Le logiciel d'analyse de mouvement lui-même ne reconnaît pas le sens de la polarité du champ et le moment de l'inversion de polarité, mais plutôt, cette information doit être obtenue à partir de la source vidéo. Cela pourrait être fait en utilisant…

Discussion

Profitant du phénomène comportemental d'abord décrit par Gabel et ses collègues et en s'appuyant sur ​​le travail de manipulation diélectrophorétique de Chuang et ses collègues ^11,12, notre test de électrotaxie microfluidique à base offre une méthode simple, robuste et sensible pour sonder l'activité neuronale dans les vers utilisant le mouvement comme une sortie. L'analyse des paramètres de mouvement permet une comparaison quantitative entre les différents génotypes. La pré…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Acetone	CALEDON Labs	1200-1-30
Methanol	CALEDON Labs	6700-1-30
Isopropanol	CALEDON Labs	8600-1-40
SU-8	Microchem Corp.	Y131273	SU-8 100
SU-8 Developer	Microchem Corp.	Y020100
92×16 mm Petri dish	Sarstedt	82.1473.001
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Dow Corning		Contains elastomer base and curing agent
Function generator	Tektronix Inc.		Model AFG3022B
Amplifier	Trek Inc.		Model 2210-CE
Syringe pump	Harvard Apparatus	70-4506	Model 11 ELITE
Hot plate	Fisher Scientific	11675916Q	Model HP131725Q