Giant Preparazione liposomi per Immagini e di patch-clamp elettrofisiologia

Summary

Ricostituzione di proteine ​​di membrana funzionale in liposomi giganti di composizione definita è un approccio efficace quando combinato con elettrofisiologia patch-clamp. Tuttavia, la produzione convenzionale di liposomi gigante può essere incompatibile con la stabilità della proteina. Descriviamo i protocolli per la produzione di liposomi giganti di lipidi puri o piccoli liposomi contenenti canali ionici.

Abstract

La ricostituzione dei canali ionici in membrane lipidiche chimicamente definite per registrazione elettrofisiologica è una tecnica potente a individuare e studiare la funzione di queste proteine ​​importanti. Tuttavia, le preparazioni classiche, come doppi strati planari, limitano le manipolazioni ed esperimenti che possono essere eseguite sul canale ricostituito e il suo ambiente di membrana. La struttura più alveolare dei liposomi giganti permette esperimenti di patch-clamp tradizionali senza sacrificare controllo dell'ambiente lipidico.

Electroformation è un mezzo efficace per produrre liposomi giganti> 10 micron di diametro, che si basa sull'applicazione della tensione alternata ad un sottile film lipidico, ordinata depositato su una superficie dell'elettrodo. Tuttavia, poiché il protocollo classico prevede i lipidi da depositare da solventi organici, non è compatibile con meno robusti proteine ​​di membrana come canali ionici e deve essere modificata. Recentemente, protocols sono stati sviluppati per electroform liposomi giganti da parzialmente disidratati piccoli liposomi, che si sono adattati a liposomi contenenti proteine ​​nel nostro laboratorio.

Presentiamo qui lo sfondo, le attrezzature, le tecniche, e le insidie ​​di electroformation di liposomi giganti da piccole dispersioni liposomi. Cominciamo con il protocollo classico, che dovrebbe essere masterizzato prima di tentare i protocolli più impegnativi che seguono. Dimostriamo il processo di disidratazione parziale controllata di piccoli liposomi con equilibrio vapore con soluzioni saline sature. Infine, abbiamo dimostrato il processo di electroformation stesso. Noi descriveremo semplice attrezzatura, poco costoso che può essere fatto in casa per la produzione di liposomi di alta qualità, e descrivere l'ispezione visiva della preparazione in ogni fase per garantire i migliori risultati.

Introduction

Liposomi giganti (spesso chiamati vescicole unilamellari giganti, o GUVs) sono stati principalmente utilizzati per lo studio della fisica e della chimica fisica di doppi strati lipidici, inclusi studi di deformazione doppio strato, la coesistenza di fase laterale ("zattere"), la fusione di membrana, ecc ^1-4. Hanno una cella grossolanamente struttura simile: guscio sferico di membrana che circonda un interno acquosa che può essere facilmente reso diverso rispetto al tampone acquoso circostante. Essi sono, per definizione, ≈ 1-100 micron di diametro, in modo che possano essere esposte utilizzando una varietà di approcci di microscopia ottica. Possono essere realizzati utilizzando gradienti osmotici tesa o dalla tensione applicata meccanicamente, in modo che mentre generalmente morbido, le loro proprietà possono essere manipolati per una facile movimentazione. In particolare, il controllo della "rigidità" del liposoma rende semplice per formare patches "liposoma iscritti" o asportato per elettrofisiologia. In passato, canale ionico ricostituzione è stata in gran parte svolta in planare lipidi bilayer. Ora, la capacità di formare le patch da liposomi giganti e utilizzare il notevole faretra di strumenti sviluppati per elettrofisiologia convenzionale (microscopia a fluorescenza, micropipetta aspirazione, rapido perfusione e il controllo della temperatura, ecc) rende liposomi giganti sempre più attraente per gli studi di ricostituzione ^5,6.

Liposomi giganti sono stati fatti da molte strategie. Infatti, liposomi giganti formano spontaneamente da un processo di rigonfiamento quando un film lipidico essiccato viene reidratato ^4,7,8. Il desiderio di preparare più rapidamente grandi, liposomi più uniformi ha portato i ricercatori ad altri approcci, primo fra tutti electroformation ^1,9. Electroformation basa anche su idratazione di un film lipidico essiccata, ma accelera il processo attraverso l'applicazione di un campo elettrico oscillante attraverso il film lipidico. Il campo viene applicato tramite due elettrodi, sia fili di platino o di indio-stagno-Oxide (ITO) vetrini rivestiti, separati da acqua otampone e su cui i lipidi sono depositati. Accelerando il gonfiore di liposomi, si raggiunge una maggiore resa di liposomi più grandi. Così, electroformation è diventato il metodo predefinito per produrre liposomi giganti ^4.

Il meccanismo di electroformation non è pienamente compreso, e la maggior parte dei protocolli sono sviluppati empiricamente (es. ^10,11). Tuttavia, siamo in grado di imparare un po 'su cosa aspettarsi considerando la teoria e alcuni risultati empirici. E 'opinione diffusa che electroformation avviene guidando il flusso elettro-osmotico di cuscinetto tra i singoli doppi strati lipidici accatastati nel film lipidico depositato ^10,11. Accoppiamento elettrostatico a fluttuazioni termiche dei doppi strati lipidici è probabilmente coinvolto anche ^12. Queste ipotesi qualitativamente predicono limiti superiori per la frequenza di campo elettrico e forza che può essere utilizzato ^10,12. In particolare, si prevede che le soluzioni ad alta conduttività ( <eM> cioè soluzioni saline fisiologiche) riducono le forze electrohydrodynamic che può avviare la electroformation liposomi ^12. Portate elettroosmotico generalmente diminuiscono all'aumentare della concentrazione di sale e sono spesso alzato a qualche campo elettrico frequenza di oscillazione (es sebbene in una diversa geometria, Green et al. ^13). Così, più elevate intensità di campo e frequenze più alte sono ragionevoli per le soluzioni ad alta conduttività, entro i limiti di ^10.

Tuttavia, proteine ​​di membrana sono suscettibili di essere incompatibile con il solito metodo di deposizione lipidi sul elettrodi per la procedura electroswelling, ossia in solventi organici che vengono poi evaporato per lasciare un sottile film lipidico. Ci sono due principali sentieri intorno a questa difficoltà: per incorporare le proteine ​​dopo la formazione di liposomi giganti, o di adattarsi come i lipidi si depositano. Il nostro approccio si basa su altri ^5,11 per depositare i lipidi e ricostituito proteina di membrana insieme da una sospensione di piccole o grandi "proteoliposomi". Descriviamo il processo lungo e più impegnativo di produrre proteoliposomi da purificata proteine ​​e lipidi altrove (Collins e Gordon, in revisione). Qui si descrive il protocollo, in assenza di qualsiasi proteina, ma è la stessa quando la proteina è compresa; includiamo risultati mostrano che proteoliposomi contenenti il ​​canale ionico TRPV1 può essere trasformato in GUVs e utilizzati per patch-clamp elettrofisiologia. In qualsiasi approccio electroformation, ispezione visiva del campione lipidi durante il processo di deposizione di lipidi è fondamentale per il successo.

Il nostro approccio può essere pertinente al di là della domanda specializzata di canale ionico ricostituzione. Nel tempo da quando abbiamo sviluppato questo protocollo e ora, è stato anche dimostrato come il modo in cui i lipidi sono depositati su elettrodi per electroformation colpisce l'eterogeneità composizionale dei GUVs risultanti. BayKal-Caglar et al. ¹⁴ hanno mostrato che GUVs formate da liposomi attentamente disidratate avevano 2,5 volte più piccola variazione nella temperatura di transizione di miscibilità GUVs formati da miscele di vari fosfolipidi e colesterolo. Il loro lavoro indica che i lipidi, e soprattutto il colesterolo, possono precipitare dalla miscela lipidica quando depositati da solventi organici, con conseguente grande variazione spaziale nella composizione del film lipidico depositato. Questo è particolarmente importante per gli studi del comportamento di fase membrana lipidica, ma può anche essere fondamentale per esperimenti quantitativi sulla funzione del canale ionico. Protocollo Baykal-Caglar et al s '.' Simile ma non identico al nostro, ed i lettori sono incoraggiati a studiare pure.

Questo protocollo (vedere la panoramica, la Figura 1) è uno dei tanti che potrebbero essere utilizzati. In linea di principio electroformation successo dipende dalla miscela lipidica, idratazione, temperatura, altri soluti (in particolare ioni), e diNaturalmente la tensione e la frequenza utilizzata in formazione. Come electroformation diventa meglio compresa, ci aspettiamo di affinare il nostro protocollo di più.

Infine, vi è spesso una ripida curva di apprendimento in elettroformatura liposomi giganti. Suggeriamo la padronanza del protocollo convenzionale (sezioni 1 e 4, e, se necessario, la sezione 5) prima di imparare a depositare i lipidi dalle sospensioni liposomiali (sezioni 2-5).

Protocol

1. Deposizione di lipidi da solventi organici: Protocollo Classica Rimuovere i lipidi dalla conservazione a -20 ° C o -80 ° C; caldo per RT. Attenzione: i lipidi sono estremamente igroscopico, e molti sono sensibili all'ossigeno. Coprire lipidi nella secca Argon o Azoto e in tutte le fasi minimizzare l'esposizione all'aria. Se necessario, sospendere i lipidi in cloroformio o cicloesano a mg / ml 1-10; notare che le concentrazioni indicate dal costruttore sono …

Representative Results

Nei nostri esempi, preparando liposomi da una miscela di circa 55% molare POPC (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphocholine), 15 mol% POPS (1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-phosphoserine , 30 mol% colesterolo, e 0.1 mol% Texas Red-etichettato 1,2-dipalmitoil-sn-phosphoethanolamine (TxR-PDPE). Questa composizione è stata scelta da circa rappresentante della radice dorsale lipidi gangliari 18. Prendiamo atto che il 15% molare addebitato lipidi (qui POPS) è vicina al limite di ciò…

Discussion

Electroformation di liposomi giganti si è sviluppato in una tecnica flessibile, compatibile con diversi lipidi, preparati, e buffer. Attento controllo del processo di deposizione lipidica è più critico per il successo. Abbiamo presentato strumenti semplici per rendere deposizione controllata di lipidi da piccole preparazioni liposomiali un processo semplice. L'umidità relativa è critica per la disidratazione dei liposomi iniziali, e il valore ottimale varia con la concentrazione iniziale di soluti nella sospens…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Digital Multimeter	Agilent Technologies, www.agilent.com	U1232A or similar	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
	Fluke	117 or 177	Any multimeter will do, but avoid old style analog ohmmeters which apply much more current to the resistance under test.
Function Generator	Agilent Technologies, www.agilent.com	33210A or similar	Most function generators work for simple protocols. This programmable model is useful for advanced electroformation protocols. Make sure the generator can drive 10 V peak-to-peak into a 50 Ω load
ITO coated glass slides	Delta Technologies, Loveland, CO www.delta-technologies.com	CB-90IN-S107 or similar	Break these in half to make two slides, 25 mm x 37 mm
Temperature controller	Omega Engineering Stamford, CT www.omega.com	CNi3233 or similar
Hygrometer	Extech, Nashua, NH, www.extech.com	445815
Silicone rubber sheet	McMaster-Carr Elmhurst, IL www.mcmaster.com	87315K64	Use USP Grade VI silicone for its high purity
EMI gasket	Laird Technologies www.lairdtech.com	4202-PA-51H-01800 or similar	Distributed by Mouser www.mouser.com
TxR-DHPE	Life Technologies, Carlsbad, CA www.lifetechnologies.com	T1395MP	Other fluorescently labeled lipids are available, but TxR-DHPE is one of the brightest and most photostable.
POPC	Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL www.avantilipids.com	850457P or 850457C	Lipids can be ordered as powders (P) or in chloroform (C)
POPS	Avanti Polar Lipids	840034P/C
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667