Levende cellecyklusanalyse af<em> Drosophila</em> Væv bruger Attune Acoustic Fokusering Cytometer og Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain
Summary
En protokol til cellecyklus analyse af levende<em> Drosophila</em> Væv ved hjælp af Attune Akustisk Fokusering cytometer er beskrevet. Denne protokol samtidig giver oplysninger om relativ cellestørrelse, celle nummer, DNA indhold og celletype via afstamning tracing eller væv specifikt udtryk for fluorescerende proteiner<em> In vivo</em>.
Abstract
Flowcytometri har været meget anvendt til at indhente oplysninger om DNA-indhold i en population af celler, at udlede relative procenttal i forskellige cellecyklusfaser. Denne teknik er blevet udvidet til mitotiske væv modelorganismen Drosophila melanogaster for genetiske studier af cellecyklusregulering in vivo. Når kombineret med celletypespecifik fluorescerende protein udtryk og genetiske manipulationer, kan man få detaljerede oplysninger om effekter på celle nummer, cellestørrelse og cellecyklus indfasning vivo. Men denne levende-celle metode har påberåbt sig brugen af cellen gennemtrængelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende farvestof, begrænser brugerne til flowcytometre udstyret med en UV-laser. Vi har ændret denne protokol til at bruge en nyere live-cell DNA farvestof, Vybrant DyeCycle Violet, forenelige med de mere almindelige violette 405nm laser. Protokollen præsenteres her tillader effektiv cellecyklusanalyse kombineret med celletype relativ cellestørrelse og celle nummer information, i en række Drosophila væv. Denne protokol udvider nyttige cellecyklusanalyse teknik for levende Drosophila væv til en lille bordplade analysator, den Attune Akustisk Fokusering cytometer, der kan køres og vedligeholdes på en enkelt laboratorieskala.
Introduction
Flowcytometri kan anvendes til måling af cellelevedygtighed, relativ cellestørrelse, DNA-indhold og fluorescerende protein ekspression i levende cellepopulationer. På grund af replikation af kerne-DNA i løbet af S-fasen, information om DNA-indhold i en population af celler kan anvendes til at udlede relative procentdel i forskellige cellecyklusfaser 1-3. Denne metode er blevet en hjørnesten i cellecyklus analyse modelsystemer fra gær til pattedyr.
Bananfluen Drosophila melanogaster er blevet en glimrende model for genetiske in vivo analyser af cellecyklusregulering. De omfattende genetiske værktøjer til rådighed på fluer mulighed for elegant væv specifikke og tidsmæssigt reguleret manipulationer af cellecyklus regulatorer sammen med in vivo fluorescerende protein-baserede afstamning sporing 4-6. Flowcytometri er blevet brugt til at studere DNA-indholdet i en række Drosophila celletyper, herunder endoreplicating celler og dyrkede mitotiske celler 7,8. Et vigtigt fremskridt for in vivo cellecyklus undersøgelser blev foretaget af de la Cruz og Edgar, med udvikling af en protokol til flowcytometrisk analyse af levende diploide Drosophila imaginal skiver 9,10, en protokol, som er blevet brugt og tilpasset af mange laboratorier. Denne teknik, når kombineret med genetisk in vivo afstamning sporing via inducerbare fluorescerende protein udtryk og væv specifik mærkning, tillader en at indhente oplysninger om genmanipulation effekt på den samlede celle fordoblingstid, cellestørrelse og bestemme præcis timing af cellecyklusfaser in vivo 9 , 11.. Men denne metode hidtil påberåbt brugen af cellen gennemtrængelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende farvestof til farvning og kvantificere DNA i levende celler, hvilket har begrænset brugerne til flowcytometre med en UV-laser kan spændende Hoechst farvestof. Disse er generelt kun findes i sorteringsanlæg (dvs. BD FACS Vantage, BD FACSAria) eller dyrt flerfarvet benchtop systemer (dvs. BD LSR), som regel kræver støtte fra de institutionelle flow core faciliteter.
Vi har ændret Hoechst-baseret protokol til at bruge en ny live-cell DNA farvestof fra Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Denne farvestof er kompatibel med en violet 405 nm laser, mere almindelig i mindre stationære analysatorer og tilgængelige i den lille selvstændig benchtop analysator, den Attune Acoustic Fokusering Cytometer. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for cellecyklusanalyse der kan kobles med celletype, cellestørrelse, celleantal og afstamning analyse i en række Drosophila væv under forskellige udviklingsstadier ved hjælp DyeCycle Violet og Attune. Denne protokol udvider antallet af cytometre egnede til en sådan analyse med Drosophila væv og giver eksempler på, hvordan denne type af levende cellecyklusanalyse kan modificeres yderligere vævstyper og udviklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet her tillader analyse af cellecyklus, relativ cellestørrelse og relative celleantal i levende Drosophila væv på forskellige udviklingsstadier. Når denne analyse er kombineret med celletypespecifik fluorescerende protein udtryk eller afstamning opsporing, kan detaljerede oplysninger indhentes om cellulære reaktioner på diskret cellecyklus eller vækst forstyrrelser. Som bevis principielt forstyrret vi ubevægelighed i puppe flyve hjernen ved at udtrykke G1-S cellecyklus regulatorer i G…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Aida de la Cruz for at udvikle og undervise den oprindelige protokol, som denne version er baseret 10. Arbejdet i Buttitta Lab er støttet af NIH tilskud GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
Referências
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
