Live-Cell Cycle Analysis of<em> Drosophila</em> Vev bruker Attune Acoustic Fokusering cytometer og Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain
Summary
En protokoll for cellesyklus analyse av levende<em> Drosophila</em> Vev ved hjelp av Attune Acoustic Fokusering cytometer er beskrevet. Denne protokollen gir samtidig informasjon om relativ celle størrelse, celle nummer, DNA innhold og celletype via avstamning tracing eller vev spesifikke uttrykk for fluorescerende proteiner<em> In vivo</em>.
Abstract
Flowcytometri har vært mye brukt for å innhente informasjon om DNA-innhold i en populasjon av celler, til å slutte relative prosenter i ulike cellesyklus faser. Denne teknikken har blitt utvidet til de mitotiske vev i organismen modell Drosophila melanogaster for genetiske studier av regulering av cellecyklus in vivo. Når kombinert med celle-type spesifikke fluorescerende protein uttrykk og genetiske manipulasjoner, kan man få detaljert informasjon om effekter på celle nummer, celle størrelse og cellesyklus innfasing vivo. Men denne live-celle metoden har vært avhengig av bruken av cellen gjennomtrengelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende fargestoff, noe som begrenser brukere å flowcytometere utstyrt med en UV-laser. Vi har endret denne protokollen for å bruke en nyere live celle DNA fargestoff, Vybrant DyeCycle Violet, kompatibel med de mer vanlige fiolett 405nm laser. Protokollen presenteres her gir mulighet for effektiv cellesyklus analyse kombinert med celletype, relativ cellestørrelse og celle nummerinformasjon i en rekke Drosophila vev. Denne protokollen utvider nyttig cellesyklus analyse teknikk for live Drosophila vev til en liten bordmodell analysator, Attune Acoustic Fokusering cytometer, som kan kjøres og vedlikeholdes på en enkelt-lab skala.
Introduction
Strømningscytometri kan brukes til måling av cellenes levedyktighet, relativ cellestørrelse, DNA-innhold og fluorescerende protein ekspresjon i levende celle populasjoner. På grunn av replikasjon av kjerne-DNA i løpet av S-fase, vil informasjon om DNA-innhold i en populasjon av celler som kan brukes til å utlede relative prosenter i forskjellige celle faser 1-3. Denne metoden har blitt en hjørnestein i cellesyklus analyse i modellsystemer fra gjær til pattedyr.
Bananflue Drosophila melanogaster har blitt et utmerket modellsystem for genetisk in vivo analyser av cellesyklusregulering. De omfattende genetiske verktøy tilgjengelig i fluer tillate elegant vevet spesifikke og timelig regulert manipulasjoner av cellesyklus regulatorer sammen med in vivo fluorescerende protein-baserte avstamning tracing 4-6. Strømningscytometri er blitt brukt til å studere DNA-innhold i et antall av Drosophila celletyper, inkludert endoreplicating celler og kulturperler mitotiske celler 7,8. Et viktig fremskritt for in vivo cellesyklus studiene ble gjort av de la Cruz og Edgar, med utviklingen av en protokoll for flowcytometrisk analyse av levende diploide Drosophila imaginal plater 9,10, en protokoll som har blitt brukt og tilpasset av mange laboratorier. Denne teknikken, når kombinert med genetisk in vivo avstamning sporing via induserbar fluorescerende protein uttrykk og vev spesifikk merking, gjør det mulig å få informasjon om genmanipulering Effekter på total celle dobling tid, celle størrelse og for å fastslå presis timing av cellesyklus faser in vivo 9 11.. Men denne fremgangsmåte har hittil vært avhengig av bruken av cellen gjennomtrengelig Hoechst 33342 DNA-interkalerende fargestoff for å farge og kvantifisere DNA i levende celler, som har begrenset antall brukere som flowcytometere med en UV-laser i stand til å eksitere Hoechst fargestoff. Disse er vanligvis bare finnes i sorters (dvs. BD FACS Vantage, BD FACSAria) eller dyrt flerfarget stasjonære systemer (dvs. BD LSR), vanligvis krever støtte av institusjonelle flyt kjernefasiliteter.
Vi har endret Hoechst-basert protokoll for å bruke en ny live-cell DNA fargestoff fra Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Dette fargestoffet er kompatibel med en fiolett 405 nm laser, mer vanlig i mindre stasjonære analysatorer og tilgjengelig i små selvstendige benchtop analysator, Attune Acoustic Fokusering cytometer. Her presenterer vi en detaljert protokoll for cellesyklus analyse som kan være kombinert med celletype, celle størrelse, mobilnummer og avstamning analyse i en rekke Drosophila vev i ulike stadier av utviklingen ved hjelp DyeCycle Violet og Attune. Denne protokollen utvider antallet cytometere egnet for slik analyse med Drosophila vev og gir eksempler på hvordan en slik levende celle syklus analyse kan modifiseres for ytterligere vevstyper og utviklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen er beskrevet her gir mulighet for analyse av cellesyklus, relativ celle størrelse og relativ celle nummer i levende Drosophila vev på ulike utviklingsstadier. Når denne analysen er kombinert med celle-type spesifikke fluorescerende protein uttrykk eller avstamning sporer kan detaljert informasjon fås om cellulære responser til diskret cellesyklus eller vekst forstyrrelsene. Som bevis på prinsippet forstyrret vi quiescence i pupal fly hjernen ved å uttrykke G1-S cellesyklus regulatorer i GFP m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Aida de la Cruz for å utvikle og undervise den opprinnelige protokollen som denne versjonen er basert ti. Arbeid i Buttitta Lab er støttet av NIH stipend GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
Referências
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
