Live cellcykelanalys av<em> Drosophila</em> Vävnader som använder Attune Akustisk Fokusering Cytometer och Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain
Summary
Ett protokoll för cellcykeln analys av levande<em> Drosophila</em> Vävnader med hjälp av den Attune Akustisk Fokusering Cytometer beskrivs. Detta protokoll ger samtidigt information om relativ cellstorlek, mobilnummer, DNA-innehåll och celltyp via härstamning tracing eller vävnad uttryck av fluorescerande proteiner<em> In vivo</em>.
Abstract
Flödescytometri har i stor utsträckning använts för att få information om DNA-innehåll i en population av celler, för att härleda relativa procentandelar i olika cellcykelfaserna. Denna teknik har framgångsrikt utvidgats till de mitotiska vävnaderna i modellen organismen Drosophila melanogaster för genetiska studier av cellcykelreglering in vivo. När den kombineras med celltypsspecifik fluorescerande protein expression och genetiska manipulationer, kan man få detaljerad information om effekterna på antalet celler, cellstorlek och cellcykeln fasa in vivo. Men denna live-cell metoden har förlitat sig på användningen av cellpermeabla Hoechst 33342 DNA-interkalerande färg, begränsa användarna till flödescytometrar utrustade med en UV-laser. Vi har modifierat detta protokoll för att använda en nyare live-cell DNA färgämne, Vybrant DyeCycle Violet, förenlig med den vanligare violett 405nm laser. Protokollet presenteras här möjliggör effektiv cellcykelanalys tillsammans med celltyp, relativ cellstorlek och cell nummerinformation, i en mängd av Drosophila vävnader. Detta protokoll förlänger användbar cellen tekniken livscykelanalys för levande Drosophila vävnader till en liten bänk analysator, den Attune Acoustic Fokusering Cytometer, som kan köras och underhållas på ett enda laboratorieskala.
Introduction
Flödescytometri kan användas för mätning av cellviabilitet, relativ cellstorlek, DNA-innehåll och fluorescerande protein uttryck i levande cellpopulationer. På grund av replikation av kärn-DNA under S-fas, information om DNA-halten i en population av celler kan användas för att härleda relativa procentandelar i olika cellcykelfaserna 1-3. Denna metod har blivit en hörnsten i cellcykelanalys i modellsystem från jäst till däggdjur.
Bananflugan Drosophila melanogaster har blivit ett utmärkt modellsystem för genetisk in vivo analyser av cellcykelreglering. De omfattande genetiska verktyg som finns i flugor möjliggöra elegant vävnad specifika och tidsmässigt reglerade manipulationer av regulatorer cellcykeln tillsammans med in vivo fluorescerande protein-baserade härstamning spårning 4-6. Flödescytometri har använts för att studera DNA-halten i ett antal Drosophila celltyper, inklusive endoreplicating celler och odlade celler mitotiska 7,8. Ett viktigt framsteg för in vivo cellcykeln studier gjordes av de la Cruz och Edgar, med utvecklingen av ett protokoll för flödescytometrianalyser av levande diploida Drosophila imaginal skivor 9,10, ett protokoll som har använts och anpassats av många laboratorier. Denna teknik, när den kombineras med genetisk in vivo härstamning spåra via inducerbar fluorescerande protein uttryck och vävnad specifik märkning, gör att man kan få information om effekterna genmodifieringstekniker på totala cell fördubbling tid, cellstorlek och att fastställa exakta tidpunkten för cellcykelfaserna in vivo 9 , 11. Men denna metod har hittills förlitat sig på användningen av cellpermeabla Hoechst 33342 DNA-interkalerande färg för att färga och kvantifiera DNA i levande celler, vilket har begränsat användare att flödescytometrar med en UV-laser med förmåga att excitera Hoechst färgämne. Dessa är i allmänhet finns endast i sorterare (dvs. BD FACS VantaGE, BD FACSAria) eller dyra multicolor bänk system (dvs. BD LSR), vanligtvis kräver stöd av institutionella anläggningar flöde kärna.
Vi har modifierat Hoechst-baserat protokoll för att använda en ny live-cell-DNA färgämne från Invitrogen, Vybrant DyeCycle Violet. Detta färgämne är kompatibel med en violett 405 nm laser, vanligare i mindre stationärmaskiner analysatorer och finns i den lilla fristående bänk analysator, den Attune Acoustic Fokusera Cytometer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för cellcykelanalys som kan kopplas med celltyp, cellstorlek, mobilnummer och härstamning analys i olika Drosophila vävnader under olika stadier av utveckling med hjälp DyeCycle Violet och Attune. Detta protokoll utökar antalet cytometrar lämpliga för sådan analys med Drosophila vävnader och ger exempel på hur denna typ av levande cellcykelanalys kan modifieras för ytterligare vävnadstyper och utvecklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillåter analys av cellcykeln, relativ cell storlek och relativa antalet celler i levande Drosophila vävnader vid olika utvecklingsstadier. När denna analys är kopplad med celltypsspecifik fluorescerande protein expression eller härstamning spårning, kan detaljerad information erhållas om cellulära svar på diskret cellcykeln eller störningar tillväxt. Som bevis på princip störs vi quiescence i PUPP flyga hjärnan genom att uttrycka G1-S regulatorer cellcykeln i GFP mä…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Aida de la Cruz för att utveckla och undervisa det ursprungliga protokollet som denna version är baserad 10. Arbete i Buttitta Lab stöds av NIH bidrag GM086517.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | |||||||||||||||
| 12×75 mm Polystyrene Round-Bottom 5 ml Test Tube | BD Falcon | 352058 | 5 ml tubes | |||||||||||||||
| Attune Acoustic Focusing Cytometer | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4445315 | Blue / Violet configuration | |||||||||||||||
| Attune Cytometer Software (version 1.2.5) | Life Technologies/ Applied Biosystems | Free | PC only | |||||||||||||||
| Attune Performance Tracking Beads (5 x 106 beads/ ml) | Life Technologies/ Applied Biosystems | 4449754 | For daily performance test | |||||||||||||||
| Dumont #5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | ||||||||||||||||
| Embryo dishes 30 mm x 12mm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dishes | |||||||||||||||
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670051 | ||||||||||||||||
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | ||||||||||||||||
| Vannas-Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | Straight 5mm Cutting Edge | |||||||||||||||
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Life Technologies/ Invitrogen | V35003 | ||||||||||||||||
| Table 1. Required reagents and instruments. | ||||||||||||||||||
Live DNA Stain Solution (10 ml): 1 ml 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2) 10X Ca2+ Mg2+ free PBS (pH7.2): 1.37M NaCl, 27 mM KCl, 100mM Na2HPO4 (dibasic), 20mM KH2PO4 (monobasic) adjusted to pH 7.2 |
||||||||||||||||||
Table 2. Threshold and voltage setting for the analysis in Figure 2. |
Referências
- Nunez, R. DNA measurement and cell cycle analysis by flow cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. 3, 67-70 (2001).
- Rabinovitch, P. S. DNA content histogram and cell-cycle analysis. Methods Cell Biol. 41, 263-296 (1994).
- Ashburner, M., Roote, J. Culture of Drosophila: the laboratory setup. CSH Protoc. , pdb ip34 (2007).
- del Valle Rodriguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nat. Methods. 9, 47-55 (2012).
- Duffy, J. B. GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist’s Swiss army knife. Genesis. 34, 1-15 (2002).
- McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Sci STKE. 2004, pl6 (2004).
- Calvi, B. R., Lilly, M. A. Fluorescent BrdU labeling and nuclear flow sorting of the Drosophila ovary. Methods Mol. Biol. 247, 203-213 (2004).
- Bjorklund, M. Identification of pathways regulating cell size and cell-cycle progression by RNAi. Nature. 439, 1009-1013 (2006).
- Neufeld, T. P., de la Cruz, A. F., Johnston, L. A., Edgar, B. A. Coordination of growth and cell division in the Drosophila wing. Cell. 93, 1183-1193 (1998).
- de la Cruz, A. F., Edgar, B. A. Flow cytometric analysis of Drosophila cells. Methods Mol. Biol. 420, 373-389 (2008).
- Reis, T., Edgar, B. A. Negative regulation of dE2F1 by cyclin-dependent kinases controls cell cycle timing. Cell. 117, 253-264 (2004).
- Milan, M., Campuzano, S., Garcia-Bellido, A. Cell cycling and patterned cell proliferation in the Drosophila wing during metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 11687-11692 (1996).
- Schubiger, M., Palka, J. Changing spatial patterns of DNA replication in the developing wing of Drosophila. Dev. Biol. 123, 145-153 (1987).
- Ashburner, M. . Drosophila; A laboratory handbook. , (1989).
- Theodosiou, N. A., Xu, T. Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. Methods. 14, 355-365 (1998).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Su, T. T., Sprenger, F., DiGregorio, P. J., Campbell, S. D., O’Farrell, P. H. P.H Exit from mitosis in Drosophila syncytial embryos requires proteolysis and cyclin degradation, and is associated with localized dephosphorylation. Genes. Dev. 12, 1495-1503 (1998).
