Vi beskriver her procedurerne for ekstraktion og oprensning af mRNA og nedbrydningsprodukter fra<em> Drosophila</em> Hoveder. Vi anvender disse teknikker til bedre at forstå de cellulære perturbationer underliggende neuronal degeneration. Disse metoder kan let skaleres og tilpasses til andre "OMIC" projekter.
Gennem det sidste årti, har vi forsøgt at forstå de molekylære og cellulære mekanismer af neuronal degeneration ved hjælp af Drosophila som model organisme. Selv bananfluer giver åbenlyse eksperimentelle fordele, har forskning i neurodegenerative sygdomme oftest har været på traditionelle teknikker, herunder genetisk samspil, histologi immunfluorescens, og protein biokemi. Disse teknikker er effektive til mekanistisk, hypotese-drevne undersøgelser, der fører til en detaljeret forståelse af den rolle enkelte gener i veldefinerede biologiske problemer. Imidlertid neurodegenerative sygdomme er meget komplekse og påvirke flere cellulære organeller og processer over tid. Fremkomsten af nye teknologier og omik alder giver en unik mulighed for at forstå de globale cellulære perturbationer underliggende komplekse sygdomme. Fleksible modelorganismer såsom Drosophila er ideelle til at tilpasse disse nye teknologier på grund af deres stærke Annottion og høj medgørlighed. En udfordring med disse små dyr, selv om, er oprensningen af tilstrækkeligt informative molekyler (DNA, mRNA, protein, metabolitter) fra yderst relevante væv såsom flyve hjerner. Andre problemer omfatter indsamle et stort antal fluer til forsøgsgentagelser (kritisk for statistisk robusthed) og udvikling af ensartede procedurer for oprensning af høj kvalitet biologisk materiale. Her beskriver vi de procedurer for indsamling tusindvis af flyve hoveder og udvinding af udskrifter og metabolitter at forstå, hvordan de globale ændringer i genekspression og metabolisme bidrager til neurodegenerative sygdomme. Disse procedurer er let skalerbar og kan anvendes til studiet af proteomik-og epigenomic bidrag til sygdom.
I det sidste århundrede har Drosophila vist sig at være et uvurderligt laboratorium redskab til at undersøge dybe biologiske spørgsmål, især i udvikling, cellebiologi, genetik og neurobiologi 1. Årsagerne til denne succes er, at frugtfluer er lette at håndtere, har en stadig voksende værktøjskasse 18, 21, 31, og har et relativt simpelt genom med høj kvalitet annotation 26. Disse tekniske fordele, kombineret med opfindsomhed og konstant innovation inden for flue samfund, har ført til brede videnskabelige bidrag, som illustreret ved tildelingen af tre Nobelpriser (1933, 1995, 2011). På det seneste har Drosophila opstået som en relevant model for at studere menneskelige sygdomme, primært udviklingsmæssige forstyrrelser, medfødte immunitet, kræft og neurodegeneration 2. Vi er især interesseret i at afdække den cellulære og molekylære basis for neurodegenerative sygdomme. Disse komplekse og forskelligartede cold er knyttet til samlinger, eventuelt opløselige oligomerer, med unormal foldede proteiner og er derfor let modelleres i fluer. Alle de store neurodegenerative sygdomme, herunder Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, flere ataksi, tauopathies, prionsygdomme og andre sjældne sygdomme, er blevet modelleret i fluer i de sidste femten år 23. Fly laboratorier har bidraget til forståelsen af disse sygdomme, hovedsageligt ved at udnytte dygtighed af Drosophila genetik til at identificere nye gener involveret i neurotoksiciteten af de patogene proteiner. Når nye gener er relevante for neurotoksisk kaskade er identificeret, er deres virkninger typisk analyseret ved traditionelle tilgange, herunder histologi at konstatere mønstre af degeneration, immunfluorescens at bestemme protein fordeling og cellulære patologi og biokemiske analyser for at vurdere mængden og typen af unormale protein konformationer . Endelig BehavIoral analyse tjener som en funktionel udlæsning af sygdomstilstande resultater. Disse veletablerede teknikker er blevet udnyttet for at undersøge bidraget af en eller nogle få kandidatgener for sygdommen, herunder oxidativ stress og mitokondriel dysfunktion 13, transkriptionel dysregulation 9, 27, 30, aberrant axonal transport og synaptisk aktivitet 14, unormal RNA biologi 9, hindrede dysreguleret cellesignalering 29, ER dyshomeostasis 6, cellulære proteostasis 33, og mange andre 23. Det er imidlertid ikke klart, hvordan disse toksiske proteiner kan forstyrre samtidigt med flere indbyrdes forbundne veje, hvad der er den tidsmæssige rækkefølge af disse ændringer, og hvad der er det relative bidrag af hver vej til patogenese. Årtiers forskning fokuseret på enkelt gen, har hypotesen drevne strategier i både mennesker og dyremodeller førte til en ufuldstændig, gådefuldt billede af de cellulære mekanismer, som forårsagerneurodegeneration. Den nuværende ringe forståelse for de nøjagtige mekanismer, ved hvilke disse giftige protein samlinger forårsager neuropatologiske er en vigtig begrænsning for udviklingen af sygdomsmodificerende behandlinger.
Vi er nu interesseret i anvendelsen af nye metoder til at forstå, hvordan disse patogene proteiner fremkalde globale mobiltjenester perturbationer. Fremkomsten af omik æra tillader dybe sondering af komplekse biologiske problemer ved hjælp af avancerede high-throughput teknologier, som kan føre til effektiv sygdomsbehandlinger i den nærmeste fremtid. Genekspression (transcriptomics) undersøgelser blev oprettet efter afslutningen af flere genomsekvenser siden af høj kvalitet annotation kan forudsige de fleste udskrifter. Den nylige anvendelse af næste generation sekventering til udskrift analyse (RNA-seq) har givet nye fordele og muligheder i forhold til microarrays, herunder en fordomsfri tilgang, forbedret kvantitativ rækkevidde, og reducerede omkostninger 32.Vi ønsker at udnytte fordelene ved RNA-seq til bedre at forstå den mest almindelige form for dominant nedarvet ataksi, spinocerebellar ataksi type 3 (SCA3) eller Machado-Joseph sygdom. SCA3 er en monogeniske, dominant sygdom med fuld penetrans, forårsaget af en CAG trinukleotid ekspansion i Ataxin3 genet (ATXN3) 16. Denne mutation fører til produktion af Atxn3 protein med en lang polyglutamine (polyQ) spor, der gør det tilbøjelige til at aggregere. Da mutant Atxn3 er neurotoksisk agent i SCA3 ansvarlig for alle sygdomsrelaterede perturbationer, dette er en ideel sygdom for anvendelse af disse nye OMIC tilgange. Derudover SCA3 var en af de tidligste neurodegenerative sygdomme modelleret i fluer 34.
Mens indføre de procedurer for indsamling stort antal flyve hoveder til RNA-seq, indså vi, at vi kunne bruge det samme materiale til udførelse globale studier af andre informative molekyler. Blandt andre nye disciplinjer, proteomik, Epigenomics og metabolomics tillader undersøgelse af cellulære patologi i en dybde, der ikke tidligere nået, dog ikke uden udfordringer. I modsætning til mRNA, kataloget af proteiner og metabolitter er temmelig ufuldstændig på dette tidspunkt på grund af de stigende vanskeligheder med at forudsige alle mulige splejsningsvarianter og endnu mere gådefulde oprindelse af alle normale og patogene metabolitter. Store bestræbelser er i øjeblikket i gang med at katalogisere proteiner i mange organismer og ved sygdomstilstande. Til dette har vi ønsket at fokusere på bidrag ændrede metabolitter til SCA3 patogenese ved hjælp af en simpel organisme, såsom Drosophila. Dette er et relativt nyt og lovende område, især med den nylige indførelse af kernemagnetisk resonans (NMR), som giver høj reproducerbarhed og ikke ødelægger prøverne 5, 24. Vi foreslår, at metabolit profilering kan bidrage til at identificere biomarkører og sygdomsmekanismer impliceret i neurodegeneratiden.
En vigtig overvejelse med disse OMIC projekter er, at de kræver store ensartede prøver (200 flyve hoveder) samt præcise rensningsteknikker at minimere eksperimentelle variation. Vi begyndte at indsamle fluer efter procedurer, vi havde brugt tidligere for microarrays og også brugt for nylig til RNA-seq 12. Men vi snart stødt på en række problemer i forbindelse med misexpressing de SCA3 konstruktioner. Først havde vi at vælge en Gal4 driver til disse eksperimenter 4, hvor målvævet til analyse var hjernen. Det oplagte valg ville være en pan-neuralt driver siden SCA3 er en hjernesygdom. Men da vi har til hensigt at indsamle mRNA og metabolitter fra hele hoveder, ville denne mulighed give blandet materiale fra væv udtrykke og ikke-udtrykkende konstruktionerne. For at generere homogene prøver, hvor alle celler udtrykker de konstruktioner, vi besluttet at bruge en svag, men allestedsnærværende driver linje, daughterless (da)-Gal4. Interestingly er mange af generne involveret i neurodegenerative sygdomme, herunder ATXN3 20, har en bred fordeling, hvilket gør valget af allestedsnærværende ekspression passende. Så vi stødt på et andet problem: allestedsnærværende udtryk for patogene Atxn3-78Q forårsagede dødelighed under udvikling. For at omgå denne dødelighed, vi indarbejdet Gal80 ts til at styre den tidsmæssige aktivering af Gal4 19. Dette tillod os at samle de eksperimentelle fluer, alder dem i op til 20 dage, fryse dem og behandle deres frysetørrede hoveder for enten RNA (TRIzol) eller metabolit (methanol-chloroform) ekstraktion (figur 1). Vi har allerede brugt denne protokol til opnåelse af prøver til transkriptomisk og metabolomisk analyser, men der er andre oplagte anvendelser af denne teknik (f.eks proteomisk eller neuro-peptidomic analyser).
Eksperimentel oversigt: Det overordnede mål med disse protokoller er at støtte indsamlingen af consistent prøver af flyve hoveder til udvinding af udskrifter og metabolitter. Det specifikke mål med disse procedurer er at erhverve fluer udtrykker Atxn3-27Q og Atxn3-78Q (ikke-patogene og patogene eksperimentelle konstruktioner) samt LacZ (kontrol-konstruktion), hvor en enkelt prøve består af 200 fly hoveder. Selv om den nuværende teknologi tillader analysen af meget små prøver, herunder enkelte celler 28, vi samlet 200 hoveder til at fjerne eksperimenterende, biologisk og teknisk variation, hvilket giver os mulighed for at identificere de cellulære forandringer forbundet med sygdommen proces med høj statistisk tillid. Denne fremgangsmåde er designet til at detektere kun de ændringer i genekspression, der er forenelige i befolkningen, lede os i retning af de mest kritiske veje køre degeneration. Da vi er interesseret i aldersbetingede forandringer i hovedet på disse fluer blev hver genotype opnået ved 1, 10, og 20 dage gamle.
Et grundlæggende aspekt af disseglobale analyser er produktion af biologiske replikater som understøtter et robust statistisk analyse. Vores tidligere erfaring med microarrays og RNA-seq tyder på, at en analyse af biologiske prøver i tre eksemplarer giver stærk statistisk signifikans af data 11, 12. Vi beskriver i afsnit 1) hvordan man kan generere en enkelt biologisk replikat (Rep 1) for hver genotype og tidspunkt. Disse procedurer kan gentages for at generere Reps 2 og 3, eller gøres parallelt, så længe hver Rep korrekt identificeret. Selvom tre Reps er målet, at sætte en fjerdedel (eller endda femte) Rep anbefales stærkt at dække spørgsmål vedrørende lavt udbytte, tab af fluer under aldring, eller utilsigtet tab af materiale (fluer, hoveder eller RNA) i en eller flere prøver.
Vi fandt, at ti krydser (flasker identificeret ved bogstaver AJ) produceret nok afkom til opnåelse af 200 dyr / genotype / tidspunkt. Den yderste forsigtighed skal anvendes for at undgå forvirring, da et stort antal flasker are kræves for at opnå en Rep (10 flasker x 3 genotyper x 3 tidspunkter = 90 flasker). Til dette, betegnet vi hver flaske med genotype, tidspunkt og flaske brev. For eksempel henviser SCA3-27Q 20E til den femte flaske (af ti) af fluer udtrykker Atxn3-27Q ældet i 20 dage. Når afkom eclose er fluerne holdes i separate hætteglas mærket med den entydige identifikationskode.
Vi fastholdt antallet af fluer opnået for hver prøve, flaske, og indsamlingssted (morgen og aften) i et Excel-regneark. Vi reviderede antallet af fluer pr hætteglasset før frysning for at tage hensyn letalitet og undslupne. Fra disse sidste tællinger, kan hætteglas tilføje 200 fluer let kan findes, før du åbner fryseren og dermed bidrage til bevarelsen af prøverne. Da fluer indsamlet fra en flaske kun kan anvendes i en Rep, vi maksimeres deres bidrag pr biologiske gentagelse, selvom alle Reps indeholdt fluer fra flere flasker. Vi reserveredefluerne fra flaskerne bruges ikke i deres planlagte Rep for andre Reps, som erstatning prøver samt andre beslægtede eksperimenter (western blot, qPCR).
Med udgangspunkt i vores tidligere erfaringer i transcriptomics 11, 12, stofskifte 15 og neurodegenerative sygdomme 6, 8, præsenterer vi her en ny protokol til indsamling tusindvis af flyve hoveder med voksen-specifik ekspression af patogene gener, og rensning af mRNA og metabolitter for RNA- seq og NMR-spektroskopi hhv. Arten af disse forsøg kræves inkorporering af flere nyskabelser inden fluen indsamling, herunder valget af et allestedsnærværende Gal4 linie og brugen af tidsmæssig regulering af genekspression. Med hensyn Gal4, allestedsnærværende ekspression af transgenerne var afgørende af to grunde. Dels et stort antal af gener involveret i neurodegenerative sygdomme, herunder ATXN3, huntingtin, amyloidprecursorprotein, og superoxiddismutase 1, blandt andre, er bredt udtrykt i neuronale og gliale celler, såvel som i andre celletyper uden for nervesystemet. Vi ønskede atkorrekt modellere dette aspekt af biologi af disse patogene gener ved at analysere konsekvenserne af allestedsnærværende udtryk i stedet for kun at fokusere på neurale udtryk. For det andet er det ikke muligt at samle flyve hjerner i stort tal, men vi kan gøre det med flyve hoveder (over 200 i tre eksemplarer pr betingelse) 11, 12. Idet homogenisering af hele hoveder blander neurale og ikke-neurale væv, allestedsnærværende transgenekspression bliver kritisk til opnåelse af ensartede RNA og metabolitter fra populationer af celler, der udtrykker de samme transgener. Det er vigtigt at bemærke, at da-Gal4 blev valgt for dets nogenlunde ligelig fordeling, ikke på grund af dens høje ekspressionsniveau, selv om en ny rapport antydede, at da-Gal4 ikke kan være helt allestedsnærværende 25. Vi havde tidligere overvejet andre allestedsnærværende Gal4 linjer, herunder arm-, Tub-og Act-GA4, men de alle viste komplekse ekspressionsmønstre i de voksne CNS og muskler, hvilket gør dem mindre endequate til denne undersøgelse. Faktisk viste immunofluorescens i voksne hjerner, som da-Gal4 inducerer udbredt, men svag ekspression, som kun akkumuleres i høje niveauer i hjernecentre bestående af et par tusinde axoner og i et lille antal store neuroner (fig. 2). Selv ekspressionsniveauerne af konstruktionerne var lave, disse forhold dramatisk reduceret overlevelse i en polyQ-afhængig måde. Dette udtryk dynamik opfyldte vores behov og samtidig holde ekspressionsniveauer lave, hvilket var vigtigt for at observere de langsomme, progressive cellulære ændringer induceret af neurotoksiske proteiner.
En forudsigelig konsekvens af at inducere allestedsnærværende ekspression af neurotoksiske proteiner, var, at det forårsagede dødelighed forud for voksen eclosion. Heldigvis er denne komplikation blev omgået med anvendelsen af Gal80 ts. Som diskuteret ovenfor genekspression nåede maksimale niveauer cirka 48 timer efter temperaturskift, hvilket passer godt med tiden frommig af eksperimentet. Én yderligere fordel ved anvendelse Gal80 ts var, at i modsætning til eksperimenter, hvor de neurotoksiske proteiner konstitutivt eksprimerede pan-neuralt, var der ingen ekspression under udviklingen af nervesystemet. Således er anvendelsen af Gal80 ts skabt en "ren" baggrund, hvor nervesystemet er ikke udsat for de toksiske virkninger af disse neurotoksiske proteiner under følsomme udviklingsstadier. Efter vores mening resulterede aktivering af genekspression i voksne i en bedre model for denne klasse af voksen-debut patologier. Men Gal80 ts også indført nogle komplikationer forbundet med temperaturændringer. Den ene var, at den voksende fluer ved lave temperaturer (18-20 ° C) forsinket livscyklus, hvilket gør forsøgene betydeligt længere. Det er også velkendt, at voksende fluer ved høje temperaturer (29-31 ° C) fremskynder deres metabolisme, som illustreret ved den afkortede levetid sammenlignet med fluer ældet ved 25 ° C. SiNCE de transskriptionelle og metaboliske undersøgelser vil blive udført i fluer alderen ved høj temperatur, kan vi forvente at se store ændringer i cellulære stress veje og energi stofskifte. Det er derfor, det var så kritisk at indføre to kontroller til eksperimentet, den ene med den ikke-patogene Atnx3-27Q og en uafhængig kontrol udtrykker LacZ. Disse kontroller vil give et grundlag for genekspression og metaboliske ændringer forbundet med høj temperatur, så vi kan identificere disse ændringer er direkte forbundet med ekspressionen af giftige Atxn3. Samlet set har vi indført en række ændringer i indsamlingen af fluer, der giver mange fordele – og et par ulemper (temperatur spørgsmål og næste afsnit) – for at studere voksen-debut, progressive sygdomme.
Selv om den tidsmæssige regulering med Gal80 ts var en nyttig Derudover er det også indført en uventet komplikation. Mens generere fluerne bærer både Gal80 ts and da-Gal4 konstruktioner i en stabil bestand, bemærkede vi, at fluer dobbelt homozygote for begge konstruktioner var levedygtige, men sterile. Siden homozygot Gal80 ts og da-Gal4 stammer var levedygtige og fertile i sig selv, er det ikke klart, hvorfor kombinationen viste lav fertilitet. Det har været kendt i nogen tid, at Gal4 er mindre giftige for Drosophila væv 22. Det er muligt, da, at den heterologe ekspression af gær transskriptionsrepressor Gal80 bidraget til toksiciteten af Gal4 ved at gribe, potentielt med det endogene transkriptionelle maskineri. Denne toksicitet kan forværres af den allestedsnærværende fordeling af Gal4 under kontrol af da et gen, der spiller en central rolle i tidlig udvikling og seksuel beslutsomhed. Uanset de underliggende årsager til sterilitet, vi udvidet Gal80 ts, da-Gal4 fluer ved at fastholde en balanceaksel kromosom i da-Gal4 samtidig holde homozygosity for Gal80 t s, hvilket antyder, at Gal4 er et mere kritisk bidragyder til sterilitet. Denne opløsning var nøglen, fordi vi brugte hundredvis af disse hanner hver anden uge til at krydse med hver af de UAS transgener. Men krydser bærer en balanceaksel skabt ekstra arbejde i forbindelse med udvælgelsen af passende afkom. Kun en fjerdedel (25%) af afkommet blev opsamlet (hunner, ikke-Afbalanceringsapparat), hvorved udvælgelsen tid, reduceres udbyttet pr flasken, og øgede antallet af flasker, der er nødvendige for at opnå mindst 200 fluer pr genotype / replikere / tid punkt. Samlet set, selv om indsamlingen af fluer blev tidskrævende på grund af de store nødvendige sæt, er vi overbeviste om, at studere cellulære ændringer kun et par timer efter aktivering af ekspressionen af patogene gener allestedsnærværende vil identificere nye og interessante processer impliceret i progressiv neurontab.
Når den genetiske design var på plads, vi betalte særlig vægt påeksperimentelle manipulationer, der kan medføre biologisk variabilitet. Først vi kun indsamlet jomfruelige hunner for at sikre homogeniteten af prøverne, selv om det betød at smide mænd og kontrol af afkom to gange om dagen. Under ældning blev højst 12 fluer holdes i samme hætteglas for at undgå overbelægning og stress. Også, før frysning, blev fluer overført til kryohætteglas uden bedøvelse og fik lov til at komme sig efter overdragelsen i 30 min. Disse tilsyneladende trivielle faktorer kan påvirke genekspression og metabolisme, indførelse variabilitet i sidste ende, som ikke ville være relevant for eksperimentet.
For at sikre kvaliteten af de frosne materialer (hoveder, RNA og metabolitter), vi betalt særlig opmærksomhed til hver detalje, der kan bidrage til vævsnedbrydning. Da fluer overføres til kryohætteglas i små mængder (op til 12 fluer pr hætteglas), måtte vi hente mange hætteglas til indsamling af 200 hoveder. Disse manipulationer blev den med største omhu i et koldt rum med tøris eller flydende nitrogen. Samlingen af fluer, adskillelse af hovedet, og oprensning af informationsmolekyler, er for tidskrævende at opdage, at materialet blev nedbrudt ved afslutningen af denne lange proces. Ud over at sikre, at materialet bevarer sin kvalitet, beskriver denne protokol adskillige trin, som maksimerer udbyttet af RNA og metabolitter, herunder frysetørring og bead beating. Disse trin er ikke påkrævet for normal ekstraktioner for RT-PCR eller kvantitativ PCR fra hele fluer, men de er kritiske for ensartet oprensning fra små prøver, såsom flyve hoveder. Vi konstateret, at andre trin påvirke udbyttet af RNA. For eksempel producerede ældre fluer signifikant færre RNA end yngre fluer, uanset af genotype. Denne observation foreslog, at ældning ved høj temperatur inducerer dramatiske ændringer. Også udtrække RNA fra 100 hoveder var faktisk mere effektiv end fra 200 hoveder, så vi fortsatte med at rense i to batches på 100 per prøve, kun at kombinere dem efter kontrol af kvalitet med BioAnalyzer. Også kolonner til mRNA oprensning syntes at mætte let, så mængden af total RNA benyttes per kolonne skal optimeres.
Metabolitter er en forskelligartet blanding af små molekyler, så kvalitetskontrol er vanskeligere end med DNA, RNA eller proteiner. Desværre er der ingen komplette katalog af metabolitter for enhver dyremodel på dette tidspunkt, noget der kan være under forandring i de kommende år takket være anvendelsen af flere teknologiske nyskabelser, herunder NMR-spektroskopi og den udvidede brug af væskekromatografi – massespektrometri ( LC-MS). Selv om NMR er mindre følsom end MS, viser mange lovende fordele, herunder uden ødelæggelse af prøver, der ikke analytiske procedurer, der indfører bias (LC), og høj reproducerbarhed, der giver statistisk sammenligning af Reps og adskillige eksperimentelle betingelser 24. Således kan prøven væregentestet for at kontrollere observationer eller re-analyseres ved LC-MS til at validere NMR-data. Her viste vi foreløbige NMR-data fra fluer, som vi bruger til at udarbejde et katalog over metabolitter i Drosophila. Denne information vil være afgørende for, hvordan ekspression af patogene gener ændrer normale stofskifte, åbne et nyt vindue til yderligere at forstå de cellulære mekanismer bag neurodegenerative sygdomme.
Nyopståede OMIC teknologi giver den bedste mulighed for at studere neurodegenerative sygdomme på et detaljeringsniveau, der ikke tidligere opnået. Måske den største hindring for at overvinde disse high-throughput undersøgelser er den trofaste samling af reproducerbare prøver, der kan analyseres med meget følsomme metoder. De procedurer indført her giver en måde at opnå denne overensstemmelse, og vil føre til resultater, der let kan sammenlignes på tværs af datasæt. Selvom vores primære forskningsinteresser involverede undersøge ændringer af gen expression og metabolitter, kan de genererede fluer også udsættes for proteom eller epigenomic analyse. Proteom og epigenomic forandringer under neurodegeneration sandsynligvis også være af afgørende betydning for sygdomsforløbet. Når det videnskabelige samfund sidste ende identificerer det fulde spektrum af molekylære ændringer, der påvirker sygdomsprocessen, vil en sand systemniveau forståelsen af sygdommen være mulig. På dette niveau vil sygdomsmodificerende behandlinger til sidst fremstår som en realitet.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Janice Santiago, Gabriel Figueroa, og Jose Herrera for teknisk bistand og Bloomington Drosophila Stock Center på Indiana University for flyve bestande. DH og CW blev støttet af midler fra NSF-IOS-1.051.890. PF-F og LMM blev understøttet af en salgsmulighed Seed Fund fra University of Florida.
Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
TRIzol | Ambion | 15596018 | |
1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
DNase I | Promega | M6101 | |
RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
Drosophila Stocks | |||
da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
Equipment | |||
Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |