Разделение мышиных эмбриональных лице эктодермы и мезенхимы
Summary
Протокол для разделения эмбриона лица эктодермы и мезенхимы описано. Мы используем диспазы II для лечения целого эмбрионов первых, анализировать все лица протуберанцы, а потом разделить лицевой эктодермы и мезенхимы.
Abstract
Орофациальные трещины являются наиболее частыми черепно-лицевых дефектов, которые влияют 1,5 на 1000 новорожденных по всему миру 1,2. Орофациальные clefting вызвана ненормальной лица 3 развитии. В человека и мыши, начальный рост и структурирование лицо опирается на несколько маленьких бутонов ткани, лицевой протуберанцы 4,5. Лицо является производным от шести основных протуберанцев: парные фронтальные процессы носа (ФНП), верхнечелюстной протуберанцы (MXP) и нижней челюсти протуберанцы (MDP). Эти протуберанцы опухоли состоят из мезенхимы, которые заключены в вышележащие эпителия. Исследования, проведенные в нескольких видов показало, что сигнализации перекрестных помех между лицевой эктодермы и мезенхимы имеет решающее значение для формирования лица 6. Тем не менее, механистического подробная информация о генах, участвующих в этих сигнальных реле отсутствует. Один из способов, чтобы получить полное представление о генной экспрессии, связывания транскрипционных факторов, и хроматина знаки, связанные с развитпинг лица эктодермы и мезенхимы, чтобы выделить и охарактеризовать разделенных отсеков ткани.
Здесь мы представляем метод разделения лица эктодермы и мезенхимы в эмбриональный день (E) 10,5, критическую стадию развития в лице мыши образование, которое предшествует слияние протуберанцев. Наш метод адаптирован от подхода, мы уже использовали для рассечения лица протуберанцы 7. В этом раннем исследовании мы заняты инбредных мышей C57BL / 6, как этот штамм стал стандартом для генетика, геномика и лицевой морфологии 8. Здесь, однако, из-за более ограниченного количества тканей в наличии, мы использовали беспородных CD-1 штамм, который дешевле купить, более надежных для животноводства, и стремящихся производить больше эмбрионов (12-18) в помете, чем любой инбредных мыши штамма 8. После эмбриона изоляции, нейтральные протеазы диспазы II был использован для лечения целого эмбриона. Тогда, лица протуберанцев были рассекатьред в аренду, и лица эктодермы была отделена от мезенхимы. Этот метод сохраняет оба лица эктодермы и мезенхимы нетронутыми. Образцы, полученные с использованием этой методики могут быть использованы для методов, включая обнаружение белка, иммунопреципитации хроматина (ChIP) анализа, микрочипов исследований, и РНК-след.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает простой способ отделить эмбриональных мышь лица эктодермы и мезенхимы основаны на начальном этапе лечения диспазы II. В предыдущих исследованиях, мы провели вскрытие лица протуберанцев до начала лечения диспазы II, но мы последовательно обнаружили, что мезен…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Irene Choi для иллюстрации эмбрионов главы на рис 1, а остальные члены лаборатории за помощь и обсуждение. Эта работа выполнена при поддержке гранта NIH DE012728 (TW)
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C . | RNAlater | Ambion | AM7021 |
Referências
- Wilkie, A. O., Morriss-Kay, G. M. Genetics of craniofacial development and malformation. Nat. Rev. Genet. 2, 458-468 (2001).
- Gritli-Linde, A. Chapter 2 – The Etiopathogenesis of cleft lip and cleft palate: usefulness and caveats of mouse models. Current Topics in Developmental Biology. 84, 37-138 (2008).
- Schutte, B. C., Murray, J. C. The many faces and factors of orofacial clefts. Human Molecular Genetics. 8, 1-7 (1999).
- Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev. Dyn. 235, 2353-2375 (2006).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: Morphogenetic and molecular mechanisms. Dev. Dyn. 235, 1152-1166 (2006).
- Reid, B. S., Yang, H., Melvin, V. S., Taketo, M. M., Williams, T. Ectodermal WNT/β-catenin signaling shapes the mouse face. Biologia do Desenvolvimento. 349, 261-269 (2011).
- Feng, W., et al. Spatial and temporal analysis of gene expression during growth and fusion of the mouse facial prominences. PLoS ONE. 4, e8066 (2009).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat. Genet. 37 (11), 1181-1186 (2005).
- Nagai, T., Aruga, J., Takada, S., et al. The expression of the mouse Zic1, Zic2, and Zic3 gene suggests an essential role for Zic genes in body pattern formation. Biologia do Desenvolvimento. 182, 299-313 (1997).
- Britsch, S., et al. The transcription factor Sox10 is a key regulator of peripheral glial development. Genes Dev. 15 (1), 66-78 (2001).
