Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H Магнитно-резонансная томография
Summary
Отслеживание ячеек с помощью МРТ получила замечательное внимание в последние годы. Этот протокол описывает маркировки дендритных клеток с фтором (<sup> 19</sup> F) частиц, богатых, в естественных условиях применения этих клеток и мониторинга степени их миграции в лимфатических узлов с<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H МРТ и<sup> 19</sup> F MRS.
Abstract
Непрерывного усовершенствования своей неинвазивный методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография (МРТ) значительно улучшили наши способности к обучению физиологических или патологических процессов в живых организмах. МРТ также оказывается, ценный инструмент для захвата трансплантированных клеток в живом организме. Начальное мечения клеток стратегии МРТ использовали контрастные агенты, которые влияют на релаксацию MR раз (T1, T2, T2 *) и приводят к повышению (T1) или истощение (Т2 *) сигнала, где меченые клетки присутствуют. Т2 * усиление агентов, таких как сверхмалых оксид железа вещества (USPIO) были использованы для изучения миграции клеток и некоторые из них также был одобрен FDA для клинического применения. Недостатком Т2 * агентов является трудность отличить сигнал исчезновения созданный меченых клеток из других артефактов, таких как образование тромбов, микро кровотечений или пузырьков воздуха. В этой статье мы опишем для разработки новой технологии для отслеживания клеток в живом, чтооснована на маркировке клеток с фтором (19 F) частиц, богатых. Эти частицы получают путем эмульгирования перфторуглеродов (ПФУ) соединения и затем используются для обозначения клеток, которые впоследствии могут быть отображены на 19 F-ЯМР. Важным преимуществом ПФУ для мобильного отслеживания в естественных условиях включают в себя (я) отсутствие углерод-связанный 19 F в живом организме, который затем выдает фон изображения без провели полный анализ selectivityand (II) возможность количественной оценки сигнала сотового на 19 F МР-спектроскопии .
Introduction
Отслеживание клеток в живом является ключевым аспектом в нескольких областях биомедицины. Для этого неинвазивных методов визуализации, которые могут выборочно локализации клеток в течение периода времени, являются чрезвычайно ценными. До разработки трехмерной магнитно-резонансная томография (МРТ), отслеживание иммунной миграции клеток было ограничено микроскопического анализа или биопсии ткани. Сотовые отслеживания с помощью МРТ приобрел огромное внимание в последние несколько лет, не только для изучения иммунной иммунологов поведение клетки в живом организме, но и для клинических и стволовые клетки исследователи. В середине 90-х годов, первые исследования наночастиц оксида железа 1 инициировали каскад событий для отслеживания клетки с помощью МРТ. Частицы оксида железа сократить время MR релаксации (T2 *) из меченых клеток и тем самым вызвать сигнал истощения в МРТ. Частицы оксида железа были использованы для обозначения макрофагов 2, р олигодендроцитовrogenitors 3 и многие другие типы клеток. Некоторые из этих частиц, также были клинически утвержденный FDA для маркировки сотовой вакцин у пациентов с меланомой 4. Поскольку в естественных условиях или бывших маркировки естественных клеток с частицами оксида железа полагается на укорочение T2 сигнал * а последняя может быть также вызвано в естественных условиях восприимчивость связанных T2 * эффекты, такие как микро кровоточит, железорудных месторождений или пузырьков воздуха, это может быть трудно определить меченых клеток в естественных условиях от других фоне T2 * вымирания сигнала 5.
В этой статье мы описываем технику для отслеживания дендритные клетки (ДК) в естественных условиях с использованием 19 F / H 1 магнитно-резонансной томографии (МРТ). Эта технология отслеживания клетка была введена только в 2005 году 6, через несколько лет после первых известных приложений для 19 F в МРТ было зарегистрировано 7. Одним из важных ADVAntage из 19 F над оксидом железа маркировки ячейки частица низкой биологической возникновения 19 F в ткани, что делает возможным отслеживание клетки очень выборочно в основном с фоном изображения без. Кроме того, можно наложить 19 F МР сигнал от трансплантированных меченых клеток с анатомическими изображениями, полученными от обычных 1H ЯМР. 19 F / 1 H ЯМР поэтому значительно значение для исследований по изучению миграции клеток в живом организме. Клетки изучали с помощью этого метода помечены 19 F-богатых частиц. Синтетически полученные из перфторуглеродов (ПФУ), состоящие в основном из углерода и атомы фтора, обычно используемые для получения частиц. Эти соединения являются нерастворимыми в воде и должны быть эмульгировали до применения в пробирке или в естественных условиях. Обычный размер частиц ПФУ, которые были использованы другими группами в естественных условиях 19 F-ЯМР экспериментов отслеживаниядиапазонах от 100 нм до 245 нм 6,8-10. Мы, однако, показали, что эффективность в маркировке дендритных клеток с перфтор-15-краун-5-эфиром (PFCE) частиц возрастает с увеличением размера частиц (> 560 нм) 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот способ применения F 19/1 H МРТ, чтобы следить за движением постоянного тока в лимфатических узлов дает возможность для изучения миграции иммунных клеток в живом организме. Дендритные клетки являются прекрасными примерами быстро мигрируют иммунные клетки, которые способн…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было профинансировано по Deutsche Forschungsgemeinschaft, чтобы SW (DFG WA +2804) и университетом грантом к ЮЗ от Экспериментальная и клиническая Научно-исследовательский центр, сотрудничества со стороны Макса Дельбрюка Центр для Молекулярной Медицины и Charité медицинский факультет в Берлине. Спонсорам не имел никакой роли в дизайн исследования, сбор и анализ данных, решения о публикации или подготовки рукописи. Мы благодарим Г-н Роберт Westphal для техническую поддержку в течение его интернатуру в нашей лаборатории.
Materials
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA |
Referências
- Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
- Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
- Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
- de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
- Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
- Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
- Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo “hot spot” MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
- Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
- Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
- Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
- Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
- Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
- Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
- Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes – a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
- Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
- Haacke, E. M. . Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).
