Övervakning dendritceller Migration hjälp<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H Magnetic Resonance Imaging
Summary
Spårning av celler med hjälp av MRI har fått anmärkningsvärd uppmärksamhet under de senaste åren. Detta protokoll beskriver märkning av dendritiska celler med fluor (<sup> 19</sup> F)-rika partiklar, in vivo tillämpning av dessa celler och övervaka omfattningen av sin vandring till dränerande lymfkörteln med<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H MRI och<sup> 19</sup> F MRS.
Abstract
Kontinuerliga framsteg inom icke-invasiv imaging modaliteter såsom magnetisk resonanstomografi (MRT) har förbättrats avsevärt vår förmåga att studera fysiologiska eller patologiska processer i levande organismer. MRT är också visat sig vara ett värdefullt verktyg för att fånga transplanterade celler in vivo. Initiala cellmärkning strategier för MRT gjort användning av kontrastmedel som påverkar MR relaxationstider (T1, T2, T2 *) och leda till en förbättring (T1) eller utarmning (T2 *) av signal där märkta celler är närvarande. T2 * förstärkande medel såsom ultrasmall järnoxid medel (USPIO) har använts för att studera cell migration och en del har också godkänts av FDA för klinisk tillämpning. En nackdel med T2 * agenter är svårigheten att särskilja signalen utdöende skapas av de märkta cellerna från andra artefakter såsom blodproppar, mikro blöder eller luftbubblor. I den här artikeln beskriver vi en ny teknik för att spåra celler in vivo sombygger på märkning av cellerna med fluor (19 F)-rika partiklar. Dessa partiklar framställes genom emulgering av perfluoriderat kolväte (PFC)-föreningar och sedan används för att märka celler som sedan kan avbildas genom 19 F MRI. Viktiga fördelar av PFC för cell tracking in vivo inkluderar (i) avsaknaden av kol-bundet 19 F in vivo, vilket sedan ger bakgrund-fria bilder och komplett cell selectivityand (ii) möjligheten att kvantifiera cell signal med 19 F MR-spektroskopi .
Introduction
Spårning av celler in vivo är en viktig aspekt i flera områden av biomedicin. För detta, noninvasive avbildningstekniker som selektivt kan lokaliserar celler under en tidsperiod är ytterst värdefulla. Före utvecklingen av tre-dimensionell magnetisk resonanstomografi (MRI), var spårning av immun cellmigration begränsad till mikroskopiska analyser eller vävnadsbiopsier. Cell spårning med hjälp av MRI har fått enorm uppmärksamhet i de senaste åren, inte bara för immunologer studerar immunceller beteende in vivo, men också för kliniska och stamceller forskare. Under mitten av 90-talet, nanopartiklar de första studierna på järnoxid 1 inledde en kaskad av utvecklingen för att spåra celler med MRI. Järnoxidpartiklar förkorta MR relaxationstid (T2 *) av de märkta cellerna och därmed orsaka signal utarmning i MR-bilder. Järnoxidpartiklar har använts för att märka makrofager 2, oligodendrocyt progenitors 3 och många andra celltyper. Några av dessa partiklar har också varit kliniskt godkänt av FDA för märkning cellulära vacciner i melanompatienter 4. Sedan in vivo eller ex vivo märkning av celler med järnoxidpartiklar åberopat en förkortning av T2 *-signalen och den senare kan även åstadkommas genom in vivo mottaglighet-relaterade T2 * effekter såsom mikro blödningar, inlåning järn eller luftbubblor, det kan vara svårt att identifiera märkta celler in vivo från andra bakgrund T2 *-signalen utdöenden 5.
I den här artikeln beskriver vi en teknik för att spåra dendritiska celler (DC) in vivo genom att anställa 19 F / 1 H magnetisk resonanstomografi (MRT). Denna cell tracking teknologi infördes först 2005 6, flera år efter de första erkända ansökningar för 19 F i MRI hade rapporterats 7. En viktig Advantage av 19 F över järnoxidpartikel cellmärkning är den låga biologiska förekomsten av 19 F i vävnad, vilket gör det möjligt att spåra celler mycket selektivt med grunden bakgrund-fria bilder. Dessutom är det möjligt att överlagra 19 F MR-signalen från de märkta transplanterade cellerna med anatomiska bilder som kommer från konventionell 1H MRI. 19 F / 1 H MRI är därför betydligt relevant för studier som undersöker cell migration in vivo. Celler studeras med denna metod är märkta med 19 F-rika partiklar. Syntetiskt-härledda perfluorkolväten (PFC) i första hand består av kol-och fluoratomer används ofta för att framställa partiklarna. Dessa föreningar är olösliga i vatten och måste emulgeras före applicering in vitro eller in vivo. Den vanliga storleken på PFC partiklar som har varit anställda av andra grupper för in vivo 19 F-MRI spårning experimentvarierar mellan 100 nm och 245 nm 6,8-10. Vi har dock visat att effektiviteten i märkning dendritiska celler med perfluor-15-kron-5-eter (PFCE) partiklar ökar med ökande partikelstorlek (> 560 nm). 11
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna metod för att anställa 19 F / 1 H MRI för att följa flödet av likström i lymfkörteln ger möjlighet att studera flyttmönster immunceller in vivo. Dendritiska celler är utmärkta exempel på snabbt migrera immunceller som kan manövrera genom tredimensionella strukturer utan tätt följa specifika substrat 17. Även den låga rumsliga upplösningen (im intervall) av den beskrivna tekniken är inte jämförbart med hög upplösning (nm) som kan uppnås med multiphot…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie har finansierats av Deutsche Forschungsgemeinschaft till SW (DFG WA 2804) och ett universitet bidrag till SW från experimentell och klinisk forskning Center, ett samarbete mellan Max Delbrück Centrum för Molekylär Medicin och Charité medicinska fakulteten i Berlin. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet. Vi tackar Robert Westphal för tekniskt stöd under sin praktik i vårt laboratorium.
Materials
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA |
Referências
- Yeh, T. C., Zhang, W., Ildstad, S. T., Ho, C. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magn. Reson. Med. 33 (2), 200-208 (1995).
- Weissleder, R., Cheng, H. C., Bogdanova, A., Bogdanov, A. Magnetically labeled cells can be detected by MR imaging. J. Magn. Reson. Imaging. 7 (1), 258-263 (1997).
- Franklin, R. J., Blaschuk, K. L., Bearchell, M. C., Prestoz, L. L., Setzu, A., et al. Magnetic resonance imaging of transplanted oligodendrocyte precursors in the rat brain. NeuroReport. 10 (18), 3961-3965 (1999).
- de Vries, I. J., Lesterhuis, W. J., Barentsz, J. O., Verdijk, P., van Krieken, J. H., et al. Magnetic resonance tracking of dendritic cells in melanoma patients for monitoring of cellular therapy. Nat. Biotechnol. 23 (11), 1407-1413 (2005).
- Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur. J. Radiol. 70 (2), 258-264 (2009).
- Ahrens, E. T., Flores, R., Xu, H., Morel, P. A. In vivo imaging platform for tracking immunotherapeutic cells. Nat. Biotechnol. 23 (8), 983-987 (2005).
- Holland, G. N., Bottomley, P. A., Hinshaw, W. S. F-19 Magnetic-Resonance Imaging. Journal of Magnetic Resonance. 28 (1), 133-136 (1977).
- Partlow, K. C., Chen, J., Brant, J. A., Neubauer, A. M., Meyerrose, T. E., et al. 19F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons. FASEB J. 21 (8), 1647-1654 (2007).
- Ruiz-Cabello, J., Walczak, P., Kedziorek, D. A., Chacko, V. P., Schmieder, A. H., et al. In vivo “hot spot” MR imaging of neural stem cells using fluorinated nanoparticles. Magn. Reson. Med. 60 (6), 1506-1511 (2008).
- Srinivas, M., Morel, P. A., Ernst, L. A., Laidlaw, D. H., Ahrens, E. T. Fluorine-19 MRI for visualization and quantification of cell migration in a diabetes model. Magn. Reson. Med. 58 (4), 725-734 (2007).
- Waiczies, H., Lepore, S., Janitzek, N., Hagen, U., Seifert, F., et al. Perfluorocarbon particle size influences magnetic resonance signal and immunological properties of dendritic cells. PLoS ONE. 6 (7), e21981 (2011).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging. J. Vis. Exp. (17), e773 (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., Romani, N., Aya, H., Deguchi, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Lanzavecchia, A., Sallusto, F. Ralph M. Steinman. 1943-2011. Cell. 147 (6), 1216-1217 (1943).
- Srinivas, M., Turner, M. S., Janjic, J. M., Morel, P. A., Laidlaw, D. H., et al. In vivo cytometry of antigen-specific t cells using 19F. MRI. Magn. Reson. Med. 62 (3), 747-753 (2009).
- Srinivas, M., Heerschap, A., Ahrens, E. T., Figdor, C. G., de Vries, I. J. (19)F MRI for quantitative in vivo cell tracking. Trends Biotechnol. 28 (7), 363-370 (2010).
- Lammermann, T., Bader, B. L., Monkley, S. J., Worbs, T., Wedlich-Soldner, R., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Liu, M. S., Long, D. M. Perfluoroctylbromide as a diagnostic contrast medium in gastroenterography. Radiology. 122 (1), 71-76 (1977).
- Kwiatkowska, K., Sobota, A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 21 (5), 422-431 (1999).
- Mitragotri, S., Lahann, J. Physical approaches to biomaterial design. Nat. Mater. 8 (1), 15-23 (2009).
- Hoult, D. I., Richards, R. E. The signal-to-noise ratio of the nuclear magnetic resonance experiment. J. Magn. Reson. 24 (1), 71-85 (1976).
- Kovacs, H., Moskau, D., Spraul, M. Cryogenically cooled probes – a leap in NMR technology. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 46 (2-3), 131-155 (2005).
- Waiczies, H., Millward, J. M., Lepore, S., Infante-Duarte, C., Pohlmann, A., et al. Identification of Cellular Infiltrates during Early Stages of Brain Inflammation with Magnetic Resonance Microscopy. PLoS ONE. 7 (3), e32796 (2012).
- Haacke, E. M. . Magnetic resonance imaging physical principles and sequence design. , (1999).
