Deze video toont de procedures die worden gebruikt om primaire culturen van embryonale groeien<em> Xenopus</em> Zenuw-en spiercellen en het nut van dit preparaat voor gelijktijdig maken van pre-en postsynaptische patch clamp opnamen.
Veel informatie over de koppeling van presynaptische ionenstromen met de release van neurotransmitter is verkregen van ongewervelde voorbereidingen, met name de inktvis gigantische synaps 1. Met uitzondering van het preparaat beschreven, enkele vertebrate preparaten bestaan waarin het mogelijk is om gelijktijdige metingen van neurotransmitters en presynaptische ionenstromen. Xenopus embryo motoneuronen en spiercellen kunnen worden gekweekt samen eenvoudige kweekmedium bij kamertemperatuur ze functionele synapsen vormen in twaalf tot vierentwintig uur, en kan worden gebruikt voor zenuwen en spieren cel ontwikkeling en synaptische interacties bestuderen enkele dagen (tot overgroei optreedt). Enkele voordelen van deze co-culturen over andere gewervelde preparaten omvatten de eenvoud van bereiding, de mogelijkheid om de culturen en werk bij kamertemperatuur behouden en de toegankelijkheid van de gereed gevormde synapsen 2-4. De voorbereiding is op grote schaal gebruikt om de biofysische eigenschappen van presynaptische ionenkanalen en de regulering van afgifte van transmitter vijf-acht bestuderen. Bovendien heeft het preparaat gegeven tot andere toepassingen waaronder de studie van neurietuitgroei en synaptogenese 9-12, moleculaire mechanismen van neurotransmitters 13-15, de rol van diffundeerbare boodschappers in neuromodulatie 16,17 pt in vitro synaptische plasticiteit 18 – 19.
Cruciale stappen in de succesvolle co-kweken van motorneuronen en spiercellen zijn het gebruik van passende gefaseerde embryo's die uit de geïnduceerde kweken van Xenopus kikkers en de zorgvuldige aseptische dissectie van de ongedifferentieerde spinale neuronen en myoblasten. Bevruchte eieren moeten worden met rust gelaten totdat ze ongeveer stadium 10 of zo als het verplaatsen van hen vroeg vaak stopt hun ontwikkeling. Gezonde embryo's zijn te herkennen aan een glad uiterlijk en een bruine en witte gevlekte kleuren. Stage 22-24 embryo het meest nuttig omdat dit het punt tijdens ontwikkeling vlak na de neurale buis gesloten en voor de myocyten aanzienlijk zijn gedifferentieerd. Daarnaast cellen van oudere embryo's niet goed dissociëren in CMF. Voorzichtigheid is geboden bij het verwijderen van de vitelline membraan als het een sterke hechting op het embryo. Het membraan moet uit elkaar worden gescheurd met een scherpe tang, zodat het embryo ontstaat intact. Een ander belangrijk precaution is om zorgvuldig de cellen plaatsen op de bodem van de cultuur schotel (in plaats van hen te laten zich daar te vestigen). Deze methode heeft de voorkeur aangezien dit de kans dat de cellen zich aan de kweekschaal.
Functionele neurotransmissie tussen zenuw en spier worden bepaald met slechts postsynaptische opname en vaak worden vastgesteld door de observatie van spontane spiercontractie na innervatie. Un-geïnnerveerde spiercellen niet trillen in cultuur. Postsynaptische opname alleen is handig voor het opnemen miniatuur eindplaat stromen of mogelijkheden, maar metingen van evoked afschakelspoel heeft presynaptische stimulatie en de correlatie van pre-en postsynaptische stromingen vereist dubbele patch-clamp.
Naast de gepaarde patch opnamewerkwijze hier beschreven, dit preparaat biedt de mogelijkheid om een derde pipet voeren op de neuronale soma 5 Dit maakt het genereren van een actiepotentiaal that kan doorgeven aan de presynaptische varicosity en leiden tot het vrijkomen van neurotransmitter. Bovendien kunnen mogelijke middelen die worden verondersteld te bemiddelen of moduleren synaptische transmissie worden geïntroduceerd aan beide zijden van de synaps: via de spiercel pipet of door diffusie uit een derde pipet geplaatst op de soma.
The authors have nothing to disclose.
Gefinancierd door de NSF (0854551).
Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
Table 1.