Modelo Murino de Cicatrização

Summary

Um modelo murino de cicatrização de feridas cutâneas que podem ser utilizados para avaliar compostos terapêuticos em contextos fisiológicos e patológicos.

Abstract

A cicatrização de feridas e reparação são os processos biológicos mais complexas que ocorrem na vida humana. Após lesão, múltiplos caminhos biológicos se tornam ativadas. Cicatrização de feridas prejudicada, o que ocorre em pacientes diabéticos, por exemplo, pode levar a resultados desfavoráveis ​​graves, como amputação. Existe, portanto, um impulso crescente de desenvolver novos agentes que promovem a cicatrização de feridas. O teste destes foi limitado a grandes modelos animais, tais como porcos, os quais são muitas vezes impraticável. Ratos representam o modelo pré-clínico ideal, uma vez que são económicos e passíveis de manipulação genética, a qual permite uma investigação mecanicista. No entanto, a cicatrização de feridas num ratinho é fundamentalmente diferente da dos seres humanos, uma vez que ocorre primeiramente através de contração. O nosso modelo murino supera esta incorporando uma tala em torno da ferida. Por imobilização da ferida, o processo de reparação é, então, dependentes de epitelização, proliferação celular e angiogênese, que de perto espelhar aprocessos biológicos de cicatrização de feridas humanas. Embora requerendo consistência e cuidado, este modelo murino não envolvem técnicas cirúrgicas complicadas e permite o teste de agentes promissores robusta que pode, por exemplo, promover a angiogénese ou inibir a inflamação. Além disso, cada rato actua como o seu próprio controlo de duas feridas são preparados, possibilitando a aplicação de tanto o composto de teste e o veículo de controlo no mesmo animal. Em conclusão, foi demonstrado um modelo prático, fácil de aprender e robusta de cicatrização da ferida, o que é comparável com a dos seres humanos.

Introduction

Cicatrização de feridas prejudicada é responsável pela morbidade e mortalidade em todo o mundo significativo, isto é particularmente verdadeiro para pessoas que sofrem de diabetes mellitus ^1,2. Nos seres humanos, a cicatrização de feridas é um processo contínuo de processos, em que há sobreposição significativa ^3. Imediatamente seguintes processos ferindo, inflamatórias são iniciadas. As células inflamatórias liberam fatores que incentivam os processos de proliferação celular, migração e angiogênese. Depois de re-epitelização e formação de tecido novo, há uma fase de remodelação, que implica tanto a apoptose ea re-organização das proteínas da matriz, como o colágeno.

A complexidade da cicatrização da ferida não pode actualmente ser replicado in vitro, e isto requer o uso de modelos animais. Até à data, os estudos de cicatrização de feridas têm-se limitado a modelos grandes animais, tais como porcos, para assegurar que os processos de cura são equivalentes e comparáveis ​​aos seres humanos. No entanto, usando o grande animals de tais estudos pode ser difícil para a casa e nem sempre são ⁴ prático. O rato de laboratório representa um modelo animal económico que pode ser facilmente manipulado geneticamente para investigação mecanicista ^5-7. No entanto, as feridas cicatrizar murino diferente ao ser humano, principalmente devido ao processo de contracção ^8. Isto é, em parte, devido a uma grande camada de músculo estriado subcutânea chamado o panículo carnoso que é praticamente ausente em humanos. Em ratinhos, esta camada muscular permite que a pele se mover independentemente dos músculos profundos e é responsável pela rápida contracção da pele a seguir ferimento.

Para superar esta limitação, a cicatrização de feridas de murino pode ser adaptado para replicar a cicatrização de feridas humana por utilização de uma tala (Figura 1) ^8,9. Neste vídeo demonstramos o modelo murino ferida splinted que elimina a contração da ferida e mais se aproxima dos processos humanos de re-epithelialização e formação de tecido novo. Neste modelo, duas excisões de espessura total, que incluem o panículo carnoso são criadas no dorso, uma em cada lado da linha média do rato. A tala de silicone é colocado em torno da ferida, com o auxílio de adesivo e, em seguida, a tala protegido com suturas interrompidas. Cada rato actua como o seu próprio controlo, com uma ferida a receber tratamento e do outro veículo de controlo, reduzindo assim o número de animais. Após aplicações tópicas, um curativo oclusivo transparente é aplicada. O penso pode ser removido quando necessário para outras aplicações tópicas e / ou para a medição da área da ferida ^10,11. Após a conclusão de experiências, o fechamento da ferida, a arquitectura morfológica e grau da neovascularização pode ser avaliada por imuno-histoquímica. Este económico e fácil de realizar modelo também pode ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas, no contexto da diabetes mellitus ou outros pathophysiologies.

Protocol

1. Preparação de talas e curativos oclusivos Esboço 10 círculos mm em 0,5 milímetros de espessura folhas de silicone e usar uma tesoura ou um soco biópsia para criar discos de silicone. Centro de uma biópsia de punção 5 mm no centro do círculo de 10 mm e pressiona firmemente para criar um orifício para formar um "doughnut" semelhante a disco que irá ser utilizada como uma tala. Esboço 10 círculos milímetros em um curativo oclusivo transparente como Opsite e usar a …

Representative Results

Uma curva de encerramento da ferida é determinada através do cálculo da média do diâmetro da ferida e expressando os resultados como uma percentagem, ou seja, 100 – (Dia 0 diâmetro / diâmetro Dia X). Nesta experiência, um composto terapêutico (ou de controlo do veículo) foi aplicada diariamente à ferida. O composto terapêutico fechamento da ferida grandemente acelerada (Figura 3). É importante notar que as talas devem ser mantidos durante o período de ensaio, como a remoção de t…

Discussion

Este é um modelo experimental murino de cicatrização de feridas cutâneas. Uma característica importante deste modelo é o uso de tampões de silicone para evitar a contracção da ferida de modo que pode ocorrer a re-epitelização e formação de tecido de novo, tornando-se o processo semelhante ao que ocorre em seres humanos. Este modelo é versátil e pode ser utilizado para avaliar a cicatrização de feridas em ambientes fisiológicos e patológicos (por exemplo, diabetes mellitus). O modelo pode tamb…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick	Invitrogen	P18178	Cut into “donuts” with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter
Biopsy punch 5 mm	Steifel	BC-B1-0500	To outline wound area to be excised
Vannas scissors 8.5 cm curved	World Precision Instruments	501232	For wound incision and excision
Dumonte #7b forceps, 11 cm	World Precision Instruments	501302	To grip skin when creating incision and excising skin
Graefe forceps, serrated 10cm	World Precision Instruments	14142	To help attach silicone splint to skin
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm	World Precision Instruments	14132
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm	Codman and Shurtleff, Inc (J&J)	80-1500	To suture the silicon rings to the skin
Ruler, 0.5 mm gradation	n/a
Calipers 0.25 mm gradation	Duckworth and Kent	9-653	To measure wound area
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m	Smith & Nephew	66030570
Rimadyl (Carprofen)	Pfizer	462986