Ex utero Eletroporação e Explantes hemisfério inteiro: um método simples Experimental de Estudos do Desenvolvimento Cortical Precoce

Resumo

Este protocolo descreve um processo melhorado que implica explante Ex utero Dissecção eletroporação, e cultura de todo hemisférios cerebrais do rato embrionário. A preparação facilita estudos farmacológicos e ensaios de função do gene durante o desenvolvimento precoce cortical.

Resumo

Desenvolvimento cortical envolve complexas interações entre neurônios e não-neuronais, incluindo elementos de células precursoras, vasos sanguíneos, meninges e da matriz extracelular associada. Porque eles fornecem um ambiente adequado organotípica, explantes fatia corticais são muitas vezes utilizados para investigar essas interações que controlam a diferenciação neuronal e desenvolvimento. Embora benéficos, o modelo de explante fatia podem sofrer de inconvenientes, incluindo a laminação celular aberrante e migração. Relatamos aqui um sistema de explante todo hemisfério cerebral para estudos do desenvolvimento cortical precoce, que é mais fácil de preparar do que fatias corticais e programas de migração organotípica consistente e laminação. Neste sistema modelo, laminação precoce e padrões de migração continuar normalmente durante um período de dois dias, in vitro, incluindo o período de separação preplate, durante o qual camada cortical prospectivo seis formas. Em seguida, desenvolvemos um electroporação utero ex (EUEP)abordagem que alcança ~ 80% de sucesso na segmentação expressão GFP para os neurônios em desenvolvimento no córtex dorsal medial.

O modelo de explante todo hemisfério faz desenvolvimento precoce cortical acessível para intervenção eletroporação, farmacológicos e abordagens de imagem ao vivo. Este método evita a cirurgia necessária de sobrevivência in utero eletroporação (IUEP) abordagens, melhorando simultaneamente a transfecção e consistência de segmentação de área. Este método irá facilitar os estudos experimentais de neuronal migração, proliferação e diferenciação.

Introdução

Os mamíferos cerebrais formas através do córtex concertada migração, proliferação e diferenciação de neurónios sucessivamente gerados. Cada neurónio nasce na zona ventricular (VZ) e migra do VZ na zona intermédia (IZ), formando a placa cortical (CP) ^1. À medida que passam através de diferentes domínios corticais, os neurónios migram exibir vários modos de ^2,3 a migração dependentes do meio extracelular e de outros elementos celulares (por exemplo, a glia radial) dentro do tecido em desenvolvimento. Neurónios corticais então prender migração no topo da placa de moldagem cortical nos processos coincidentes de prisão migração neuronal e

Protocolo

1. Anteriores electroporações utero com expressão da proteína verde fluorescente plasmídeo

1. Soluções para injecção de DNA de plasmídeo são preparados com CAG-eGFP DNA ²⁷ diluído para a concentração de trabalho final de 0,33 mg / ml em DDH ₂ O. Qiagen Endo-free Maxi-Preps são utilizadas para purificar o plasmídeo a partir de bactérias transformadas. Corante verde rápido a ~ 0,02% (w / v final) é adicionado à solução de DNA, como um marcador de injecção.
2. Para preparar a área cirúrgica, spray para baixo bancada de trabalho e estágio estereomicroscópio com uma solução de etanol 70% e seque. Pulverizar uma tesour....

Resultados

O roedor córtex embrionário apresenta um gradiente neurogenético transversal ao longo do período de desenvolvimento, tais neocórtex que lateral é aproximadamente 1 dia mais maduro do que neocórtex dorsal medial ^28. A maior parte da camada 6 neurónios são assim gerado (isto é, exibem a sua última fase S) na E12 no córtex lateral (também chamado Campo 40 ⁵⁾ e em E13 no córtex medial dorsal (também chamado campo 1 ^5). Dividindo Preplate começa aproximadamente 1 dia após geração neu.......

Discussão

Temos melhorado e avaliadas num modelo experimental - explantes hemisfério inteiros - para o estudo do desenvolvimento cortical precoce (E13-E15). O modelo mostrou-se útil para a análise de migração e diferenciação da linhagem neuronal excitatória que constitui a camada 6 do córtex cerebral ^25,37. As principais vantagens do sistema são: 1) crescimento organotípica DIV para 2, 2) simplicidade de preparação, e 3) o acesso aos neurónios experimental para a manipulação de electroporação, farmacológicas e de image.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Suplemento 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Suplemento Sem Soro 50X	Invitrogen	1504-044
Caneta / Estreptococo Líquido 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Inserção de cultura revestida com colágeno	Costar	3492
Gelatina de pele bovina	Sigma	G9382
H– chst 33342	Invitrogen	H1399
Albumina de Soro Bovino	Sigma	7906
Kit Maxi de Plasmídeo EndoFree	Qiagen	12362
Equipment
BTX 830 Eletroporador	Harvard Apparatus	450052
Pinça eletrodos 10mm	Harvard Apparatus	450166
Incubadora	Billups Rothenberg	MIC-101
Seringa Hamilton (5uL)	Hamilton	87930
Agulha de seringa Hamilton	Hamilton	7803-04	Especifique 1" e estilo 4
Dumont #5 Fórceps	FST	11251-10
Tesoura Fina Corte Resistente 9 cm	FST	14058-09