Ex utero elektroporatie en Whole halfrond Explantaten: Een eenvoudige experimentele methode voor bestudering van vroege corticale ontwikkeling

Summary

Dit protocol beschrijft een verbeterde explantaat procedure die inhoudt dat<em> Ex utero</em> Elektroporatie, dissectie en de cultuur van volledige hersenhelften uit de embryonale muis. De voorbereiding vergemakkelijkt farmacologische studies en analyses van gen-functie tijdens de vroege corticale ontwikkeling.

Abstract

Corticale ontwikkeling brengt complexe interacties tussen neuronen en niet-neuronale elementen waaronder precursor cellen, bloedvaten, meninges en bijbehorende extracellulaire matrix. Omdat ze een geschikte organotypische omgeving worden corticale slice explantaten vaak gebruikt om de interacties die neuronale differentiatie en ontwikkeling controleren onderzoeken. Hoewel nuttig, kan de slice explantaat model last hebben van nadelen waaronder afwijkende cellulaire lamineren en migratie. Hier rapporteren geheel hersenhelft explant voor studies van vroege corticale ontwikkeling die gemakkelijker te bereiden dan corticale schijfjes en shows consistente organotypische migratie en lamineren. In dit modelsysteem vroege lamineren en migratiepatronen normaal doorgaan gedurende twee dagen in vitro, inclusief de periode van preplate splitsen, waarbij potentiële corticale laag zes vormen. Vervolgens hebben we ontwikkelden een ex utero elektroporatie (EUEP)aanpak die ~ 80% succes bij de opsporing van GFP expressie om neuronen te ontwikkelen in de dorsale mediale cortex bereikt.

De hele halfrond explantatie model maakt vroege corticale ontwikkeling toegankelijk voor elektroporatie, farmacologische interventie en live imaging benaderingen. Deze methode vermijdt het voortbestaan ​​operatie vereist van in utero elektroporatie (IUEP) benaderingen, terwijl het verbeteren van zowel de transfectie en areal gericht consistentie. Deze werkwijze vergemakkelijkt experimentele studies van neuronale proliferatie, migratie en differentiatie.

Introduction

De zoogdieren hersenschors vormen door de gecoördineerde proliferatie, migratie en differentiatie van achtereenvolgens gegenereerde neuronen. Elk neuron is geboren in de ventriculaire zone (VZ) en migreert van de VZ in de tussenliggende zone (IZ), de vorming van de corticale plaat (CP) ^1. Als ze door verschillende corticale gebieden, de migrerende neuronen tonen verschillende modi van migratie ^2,3 die afhangen van het extracellulaire milieu en andere cellulaire elementen (bijv. radiale glia) in de zich ontwikkelende weefsel. Corticale neuronen dan arresteren migratie bovenaan de vormende corticale plaat in de samenvallende processen van neuronale migratie arrestatie en dendritogenesis ^4.

Corticale ontwikkeling wordt gestart tussen embryonale dag 11-13 (E11-13) ⁵ tot oprichting van de primordiale plexiform laag ⁶ of preplate (PP), een laag van pionier neuronen die ligt over de VZ. Aanstaandelaag 6 corticale neuronen (dwz de eerste corticale neuronen geboren in de VZ), dan oriënteren hun somata in een stereotype patroon en samenvloeien tot een aparte laag in de PP ^7. Deze gebeurtenissen splitsing van de preplate in een oppervlakkige marginale (toekomstige corticale laag 1) en een diepe zone, waarbij de laatste bestaat uit aansluitplaat cellen (voorbijgaande corticale laag 7). Dit proces, genaamd preplate splitsen, is een fundamentele gebeurtenis in de toekomstige groei van de hersenschors ^8.

Veel genetische mutaties geïdentificeerd die verstoren de verschillende aspecten van de corticale ontwikkeling ^9. Corticale ontwikkeling kan ook negatief worden beïnvloed door blootstelling aan geconsumeerde stoffen als cocaïne ¹⁰ en alcohol ^11. Omdat corticale afwijkingen die ontstaan ​​tijdens de ontwikkeling zijn waarschijnlijk bijdragen aan neurologische aandoeningen (bijv. autisme, schizofrenie), empirische onderzoeken van storingen aan de corticale ontwikkeling zijn inherently belangrijk. Het is daarom van groot belang om benaderingen vast te stellen corticale ontwikkeling dat een snelle testen van genetische of toxine effecten toestaan, maar dat ook de mogelijke interacties tussen differentiëren neuronen, andere celtypes en extracellulaire matrix (ECM) behouden tijdens deze vroege periode van ontwikkeling van de hersenen ^{12 studiepunten} .

Slice explantaten ¹³ hebben een dergelijk systeem en zijn alom gebruikt voor het testen corticale neuron ontwikkeling ^14-16. Echter, slice assays het nadeel dat neuronale migratie en lamineren kan abnormaal mogelijk ¹⁷ door schade aan de meningeale cellen die de ontwikkelende hersenen en verankeren de radiale gliale steiger omringen. Als radiale gliale vezels een belangrijk substraat voor corticale neuron migratie ¹⁸ verstoring van de basale lamina door het snijden kan plaatselijk verstoren radiale gliale architectuur en leiden tot gewijzigde corticale migratie. Bovendien de sliCED oppervlakken van explantaten biedt een regio van dode cellen die de normale samenstelling van de ECM in deze gebieden kunnen veranderen.

Meer recente benaderingen richtten hun analyse op cellen diep in de slice die worden omringd door passende gezonde soorten cellen en ECM. In sommige gevallen deze nieuwere benaderingen vereisen dat de oorspronkelijke dikke plak gekweekte cryo-sectie of paraffine secties na fixatie zodat de relatief normale inwendige van het segment beschikbaar is voor analyse ^19-21. Zowel de originele vibratome snijden de live segmenten voor cultuur en de daaropvolgende cryosectioning vaste segmenten voor analyse te maken dient zorg en inspanning voor deze assays werken.

Om een eenvoudige en complementaire aanpak voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling te bieden, hebben we gewijzigd van een bestaande slice benaderingen ¹³ tot studies van de vroege corticale ontwikkeling mogelijk te maken. We hebben een whole halfrond explantaat model vergelijkbaar met een bestaande E14 hele halfrond model dat schudden culturen die op 65 omwentelingen per minuut en toegestane organotypische groei gedurende 16-18 uur ^22,23. In onze benadering worden volledige halfrond explantaten bovenaan semi-permeabel membraan ¹³ met een zuurstofrijke atmosfeer cultuur ^21,24 tot organotypische corticale groei verlengen gedurende 48 uur. Deze aanpak maakt het ook mogelijk consistente elektroporatie ontwikkelen corticale neuronen. De embryo's verwijderd uit de baarmoeder en geëlektroporeerd met plasmide DNA te introduceren en de grote hersenen wordt dan ontleed. Elk halfrond is geïsoleerd en geplaatst mediale zijde naar beneden op een collageen gecoate filter. Het explantaat wordt vervolgens gekweekt gedurende 48 uur, een periode die preplate splitsing ⁸ omvat. Tijdens de kweekperiode, L6 neuronen ontwikkelen van voorloper van gedifferentieerde neuron ^25, de juiste positie binnen de corticale plaat. Gedurende deze periode is de ontwikkeling vanneuron wordt omringd door de juiste ECM en celtypen die de desbetreffende cel in vivo zouden voordoen. Dit systeem heeft al bewezen waardevol bij het ​​ontcijferen van de cellulaire gebeurtenissen die ethanol toxiciteit ^26, laag 6 vorming en preplate splitsen ^7,25 ten grondslag liggen.

Protocol

1. Ex utero elektroporaties met Green Fluorescent Protein expressieplasmide Plasmide DNA injectieoplossingen worden bereid met CAG-eGFP DNA 27 verdund tot de uiteindelijke werkende concentratie van 0,33 mg / ml in ddH 2 O. Endo-Free Qiagen Maxi-Preps worden gebruikt om het plasmide te zuiveren van getransformeerde bacteriën. Fast green kleurstof bij ~ 0,02% (w / v final) toegevoegd aan de DNA oplossing als injectie tracer. Om het operatiegebied te bereiden, Spuit werk…

Representative Results

De embryonale knaagdier cortex vertoont een dwarse neurogenetische gradiënt gedurende de ontwikkelingsperiode, zodanig dat laterale neocortex is ongeveer 1 dag volwassener dan dorsale mediale neocortex 28. Het grootste deel van laag 6 neuronen aldus verkregen (dwz vertonen hun laatste S-fase) op E12 in laterale cortex (ook wel Field 40 5) en E13 in de dorsale mediale cortex (ook wel Field 1 5). Preplate splitsen begint na ongeveer 1 dag Laag 6 neuron generatie en dus wordt inge…

Discussion

We hebben verbeterd en geëvalueerd een experimenteel model – hele halfrond explantaten – voor de studie van de vroege corticale ontwikkeling (E13-E15). Het model nuttig is gebleken voor de analyse van migratie en differentiatie van de excitatoire neuron lijn die laag 6 van de cerebrale cortex ^25,37 vormt. De belangrijkste voordelen van het systeem zijn 1) organotypische groei 2 DIV, 2) eenvoud van bereiding en 3) experimentele toegang tot de neuronen voor elektroporatie, farmacologische manipulatie en beeldv…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments (optional)
Reagents
DMEM/F12 + GlutaMAX	GIBCO	10565
G5 Supplement 100X	Invitrogen	17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50X	Invitrogen	1504-044
Pen / Strep Liquid 100X	Invitrogen	15140-122
HBSS 500 ml	GIBCO	14025
Culture insert collagen coated	Costar	3492
Bovine skin gelatin	Sigma	G9382
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Bovine Serum Albumin	Sigma	7906
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362
Equipment
BTX 830 Electroporator	Harvard Apparatus	450052
Tweezer electrodes 10mm	Harvard Apparatus	450166
Incubator	Billups Rothenberg	MIC-101
Hamilton syringe (5 uL)	Hamilton	87930
Hamilton syringe needle	Hamilton	7803-04	Specify 1″ and style 4
Dumont #5 Forceps	FST	11251-10
Fine Scissors Tough Cut 9 cm	FST	14058-09