Post-inbäddade immunoguld Märkning av Synaptic proteiner i hippocampus slice kulturer
Summary
Lokaliseringen och distribution av proteiner ger viktig information för att förstå deras cellulära funktioner. Den överlägsna rumsliga upplösningen av elektronmikroskopi (EM) kan användas för att bestämma den subcellulära lokaliseringen av ett givet antigen efter immunohistokemi. För vävnader i centrala nervsystemet (CNS), bevarar strukturell integritet bibehållen antigenicitet har varit särskilt svårt i EM studier. Här antar vi ett förfarande som har använts för att bevara strukturer och antigener i CNS för att studera och karakterisera synaptiska proteiner i råtta hippokampala CA1 pyramidala neuroner.
Abstract
Immunelektronmikroskopi är ett kraftfullt verktyg för att studera biologiska molekyler på subcellulär nivå. Antikroppar kopplade till elektron-täta markörer såsom kolloidalt guld kan avslöja lokaliseringen och distributionen av specifika antigener i olika vävnader 1. De två mest använda teknikerna är pre-inbäddning och efter inbäddning tekniker. I pre-inbäddning immunoguld-elektronmikroskopi (EM) tekniker måste vävnaden permeabiliserade att tillåta antikroppar penetration innan den är inbäddad. Dessa tekniker är idealiska för att bevara strukturer men dålig penetrering av antikroppen (ofta endast de första få mikrometer) är en avsevärd nackdel 2. De efter inbäddning märkning metoder kan undvika detta problem eftersom märkningen sker delar av fasta vävnader där antigener är mer lättillgängliga. Under årens lopp har ett antal modifieringar förbättrat efter inbäddning metoder för att öka immunoreaktiviteten och bevara ultrastruktur <sup> 3-5.
Vävnadsfixering är en viktig del av EM studier. Fixativ tvärbinder kemiskt makromolekylerna att låsa vävnadsstrukturer på plats. Valet av fixativ påverkar inte bara strukturellt bevarande utan också antigenicitet och kontrast. Osmiumtetroxid (OSO 4), formaldehyd och glutaraldehyd har varit standard fixativ i årtionden, bland annat för centrala nervsystemet (CNS) vävnader som är särskilt utsatta för strukturell skada under kemisk och fysikalisk behandling. Olyckligtvis, är OSO 4 mycket reaktiv och har visat att maskera antigener 6, vilket resulterar i dålig och otillräcklig märkning. Alternativa metoder för att undvika kemisk fixering inkluderar frysning vävnaderna. Men dessa tekniker är svåra att utföra och kräver dyrbar instrumentering. För att lösa några av dessa problem och att förbättra CNS-vävnad märkning Phend et al. ersatt OSO 4 med uranylacetat (UA) och garvsyra acid (TA), och framgångsrikt infört ytterligare ändringar för att förbättra känsligheten hos antigen och strukturell konservering i hjärnan och ryggmärgsvävnad 7. Vi har antagit denna osmium-fri efter inbäddning metod för råtthjärna vävnad och optimerat immunoguld märkning teknik för att detektera och studera synaptiska proteiner.
Vi presenterar här en metod för att bestämma den ultrastrukturella lokalisering av synaptiska proteiner i råtta hippokampala CA1 pyramidala neuroner. Vi använder organotypic hippocampus odlade skivor. Dessa skivor upprätthålla trisynaptic kretsen i hippocampus, och sålunda är speciellt användbara för att studera synaptisk plasticitet, tänkte en mekanism allmänt att ligga bakom inlärning och minne. Organotypiska hippokampala skivor från postnatala dag 5 och 6 mus / råtta valpar kan framställas såsom beskrivits tidigare 8, och är särskilt användbara för akut ÖVERVÄLDIGANDE eller överuttrycker exogena proteiner. Vi har tidigare använt detta protokoll till characterize neurogranin (Ng), en neuron-specifikt protein med en kritisk roll vid reglering av synaptisk funktion 8,9. Vi har också använt det att karakterisera ultrastrukturella lokalisering av kalmodulin (CaM) och Ca 2 + / CaM-beroende proteinkinas II (CaMKII) 10. Som illustreras i slutändan kan detta protokoll god ultrastrukturella bevarande av Dendritutskotten och effektiv märkning av Ng för att karakterisera sin distribution i ryggen 8. Vidare kan det förfarande som beskrivs här har bred tillämpbarhet i studera många andra proteiner involverade i neuronala funktioner.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll har vi antagit Phend och Weinberg metod för hjärna och ryggmärgsvävnad att studera Dendritutskotten i råtta hippocampus slice kulturer. Dendritutskotten i hippocampus CA3-CA1 området är känsliga strukturer som innehåller ett stort utbud av proteiner som spelar en viktig roll i regleringen av neuronala funktioner. Denna metod ger en balanserad strategi för att uppnå förbättrad antigenicitet bibehållen god ultrastrukturella konservering (figur 2A), som medger rimlig märkni…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Matt Florens för beredning av hippocampus slice kulturer. Detta arbete har finansierats med bidrag från US National Institute on Aging och Alzheimers Association till NZG.
Materials
| NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
Referências
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
- Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
- Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
- Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
- Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
- Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
- Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
- Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
- Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275 (2012).
- Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
- Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
- Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
- Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
- Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5′-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 .
- Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
- Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
- Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, (1992).
- Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
- Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
- Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
- Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
- Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , 383-426 (1999).
