Высокая пропускная Функциональная Скрининг с использованием Домашнее двойного свечения люциферазы
Summary
Мы представляем быстрый и недорогой метод скрининга для выявления транскрипционных регуляторов с использованием высокой пропускной роботов трансфекций и самодельный двойного свечения люциферазы. Этот протокол быстро генерирует прямые бок о бок функциональные данные для тысяч генов и легко изменяемый целевой любой интерес ген.
Abstract
Мы представляем быстрый и недорогой протокол высокопроизводительного скрининга для выявления транскрипционные регуляторы альфа-синуклеина, гена, связанного с болезнью Паркинсона. Клетки 293Т временно трансфицировали плазмидами, из упорядоченной библиотекой экспрессии ORF, вместе с репортера люциферазы плазмиды, в формате один ген-на-луночный микропланшет. Активность люциферазы Firefly анализируют после 48 часов, чтобы определить влияние каждого гена библиотеки на альфа-синуклеина транскрипции, нормированной к выражению из конструкции внутреннего контроля (промоутер ЦМВ направляя Renilla люциферазу). Этот протокол облегчается помощью настольного робота, заключенный в шкафу биобезопасности, который выполняет асептической обработки жидкого в формате 96-а. Наш автоматизированный протокол трансфекции легко адаптируется к высокой пропускной производства библиотеки лентивирусный или других функциональных протоколов скрининга, требующих тройных трансфекций большого числа уникальных библиотечных плазмид в сопряnction с общим набором вспомогательных плазмид. Мы также представляем недорогой и проверенную альтернативу коммерчески доступные, двойные люциферазы реагентов в которой работает PTC124, ЭДТА, и пирофосфат для подавления светлячка активность люциферазы перед измерением Renilla люциферазы. Используя эти методы, мы провели скрининг 7670 генов человека и определили 68 регуляторов альфа-синуклеина. Этот протокол можно легко модифицировать в отношении других представляющих интерес генов.
Introduction
Способность идентифицировать ключевые генетические регуляторные элементы и факторы, которые действуют на них имеет основополагающее значение для изучения многочисленных биологических процессов. Тем не менее, выявление факторов, которые регулируют экспрессию генов в редких типов клеток, таких как конкретных нейронных популяций, может оказаться непростой задачей. Здесь мы приводим протокол для выявления новых регуляторов транскрипции альфа-синуклеина (SNCA), ген, связанный с болезнью Паркинсона и выражается в дофаминергических нейронов в substantianigra Парс компакты область среднего мозга. Мы добиваемся этого с помощью высокой пропускной двойного люциферазы, в пробирке репортер экран деконструировать выражение альфа-синуклеина в клетках 293Т. Альфа-синуклеина промотор сначала клонировали в репортерной плазмидой, содержащей ген люциферазы светлячка. Коммерчески доступный плазмиду, содержащую люциферазы Renilla под контролем постоянно активной промотора служит в качестве внутреннего контроля. Фесе репортер конструкции котрансфицируют в клетках 293Т в микропланшетах с плазмидами с библиотекой экспрессии ДНК, так, что каждый хорошо трансфицируют с одной плазмидной библиотеки. Через 48 ч активность люциферазы для каждого репортера измеряется последовательно с использованием двойного свечения анализа. Относительную экспрессию альфа-синуклеина в ответ на каждый библиотеки генов выводится на отношение светлячка: активности люциферазы Renilla в каждой лунке (F: отношение R) после пластины на основе нормализации.
Этот протокол обеспечивает возможность экранировать большое количество генов (~ 2500 в неделю) за их способность трансактивировать ген-репортер с использованием минимального рабочей силы (на 1-2 человек) и минимальную стоимость (около $ 3 Стоимость реагента на микропланшет анализа). Транскрипционных регуляторов из нейрональных генов (например, альфа-синуклеина), которые трудно изучать в культуре нейронов огнеупорных в генетических манипуляций, можно сравнить бок о бок в этой прямой функциональном анализе. Мы включаем в нашПротокол подробный способ для клонирования и роста плазмид, содержащих альфа-синуклеина промотор, так как мы обнаружили, что плазмиды, содержащие эту область нестабильны при выращивании с обычными способами (см. обсуждение). Мы также включать недорогую альтернативу коммерчески доступные двойного люциферазы реагенты для высокой пропускной анализов. Этот протокол может быть легко адаптирована в отношении других регуляторных элементов, представляющих интерес, или к любому процессу, требующих высокой пропускной способности временной трансфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Альфа-синуклеина был вовлечен в болезни Паркинсона (БП) в качестве компонента тельцами Леви, 4 внутриклеточных включений, рассмотренных патогномоничными для заболевания. Многочисленные генома исследования ассоциации связывают одиночных нуклеотидных полиморфизмов в альфа-сину…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джона Darga в MGH ДНК сердечниками для подготовки скрининга ДНК библиотеки. Кристофер Chigas Перкин Элмер оказали неоценимую поддержку нашей Wallac 1420 люминометра. Стивен Ciacco и Мартин Thomae из Agilent оказала поддержку робота Браво. Мы благодарим Рон Джонсон и Стив Тита на NIH для щедро обеспечивая их протокол анализа люциферазы двойного свечения.
Materials
| Material | |||
| QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Quick Gel Extraction Kit | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Micro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent | – | |
| Robot Pipet Tips with Filter | Agilent | 19477-022 | |
| Robot Pipet Tips without Filter | Agilent | 19477-002 | |
| Clear-bottomed 96-well Plates | Corning | 3610 | |
| Reservoirs | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polystyrene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651101 | |
| Polypropylene V-bottomed 96-well Plate | Greiner | 651201 | |
| Adhesive Plate Covers | CryoStuff | #FS100 | |
| Reagent | |||
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Calf Intestine Alkaline Phosphatase | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Competent Cells | Invitrogen | 11635-018 | |
| Subcloning Efficiency DH5α Competent Cells | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM without Phenol Red | Invitrogen | 31053-028 | |
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Ciprofloxacin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hydrochloride Powder | Sigma | 93287 | |
| Tris-Base Powder | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Pure Liquid | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| Coenzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
Referências
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L. Functional analysis of intra-allelic variation at NACP-Rep1 in the alpha-synuclein gene. 113 (5), 426-431 (2003).
- Scherzer, C. R., et al. GATA transcription factors directly regulate the Parkinson’s disease-linked gene α-synuclein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 10907-10912 (2008).
- Spillantini, M. G., Schmidt, M. L., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q., Jakes, R., Goedert, M. α-Synuclein in Lewy Bodies. Nature. 388 (6645), 839-840 (1997).
- Pankratz, N., et al. Meta-analysis of Parkinson’s disease: identification of a novel locus, RIT2. Ann. Neurol. 71 (3), 370-384 (2012).
- Satake, W., et al. Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).
- Simón-Sánchez, J., et al. Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson’s disease. Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).
- Polymeropoulos, M. H., et al. Mutation in the alpha-synuclein gene identified in families with Parkinson’s disease. Science. 276 (5321), 2045-2047 (1997).
- Ibáñez, P., et al. Causal relationship between a-synuclein gene duplication and familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1169-1171 (2004).
- Chartier-Harlin, M. -. C., et al. a-Synuclein locus duplication as a cause of familial Parkinson’s disease. Lancet. 364 (9440), 1167-1169 (2004).
- Singleton, A. B., et al. a-Synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science. 302 (5646), 841 (2003).
- Ahn, T. -. B., et al. a-Synuclein gene duplication is present in sporadic Parkinson disease. Neurology. 70 (1), 43-49 (2008).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc. Nat. Acad. USA. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Montigny, W. J., et al. Parameters influencing high-efficiency transfection of bacterial artificial chromosomes into cultured mammalian cells. Biotechniques. 35, 796-807 (2003).
- Gorman, C. M., Moffat, L. F., Howard, B. H. Recombinant genomes which express chloramphenicol acetyltransferase in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 2 (9), 1044-1051 (1982).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a Component of the Yeast Origin Recognition Complex by a One-Hybrid System. Science. 262, 1870-1874 (1993).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouseGenome. Nature. 488, 116-120 (2012).
- Fan, F., Wood, K. Bioluminescent assays for high-throughput screening. Assay Drug Dev. Technol. 5 (1), 127-136 (2007).
- Hampf, M., Gossen, M. A protocol for combined Photinus and Renilla luciferase quantification compatible with protein assays. Anal. Biochem. 356 (1), 94-99 (2006).
- Auld, D. S., Thorne, N., Maguire, W. F., Inglese, J. Mechanism of PTC124 activity in cell-based luciferase assays of nonsense codon suppression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (9), 3585-3590 (2009).
- Pearlberg, J., et al. Screens using RNAi and cDNA expression as surrogates for genetics in mammalian tissue culture cells. Cold Spring Harb.Symp. Quant. Biol. 70, 449-459 (2005).
