マイクロコンタクトプリントスルーアライン機能心筋組織の生成
Summary
整列心筋組織の生成が臨床的に有用な目的のために、幹細胞生物学の最近の進歩に適応させるための重要な要件です。ここに我々は、細胞の形や機能の正確な制御のためのマイクロコンタクトプリントのアプローチについて説明します。心臓前駆細胞由来の胚性幹細胞の高度に精製された集団を使用して、我々はそれから異方性、機能心筋組織を生成します。
Abstract
高度な心不全は、生存および/または完全に機能する心筋細胞の損失から生じる、主要な臨床上の満たされていない課題である。最適な薬物療法にもかかわらず、心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因を表しています。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroでの正常および病的な人間の心筋の生理学を再現細胞アッセイの識別である。同様に、回生心臓生物学における主要な課題は、臨床的に関連する量で患者固有心筋前駆細胞の同定および単離を中心に展開。これらの細胞は、ネイティブ心臓組織構造に似ている機能的な組織に組み込まれなければならない。マイクロコンタクトプリントは、このように空間的に細胞接着を制御するために幾何学的な手がかりを提供して、心臓の構造組織に似ている正確なマイクロパターンタンパク質形状の作成 が可能になります。ここに我々は非常にin vitroで 、細胞外マトリックスタンパク質とマイクロパターン化細胞成長表面の生成、および異方性の心筋組織への幹細胞由来の心筋細胞の集合体で分化する多能性幹細胞から心筋細胞を精製単離するための我々のアプローチについて説明します。
Introduction
薬物療法における最近の進歩にもかかわらず、高度な心不全は、先進国における死亡率と罹患率の主要な原因のままです。臨床症状は、機能心筋組織の損失および罹患した個体の代謝要求を満たすために、心不全のその後不能から生じる。心臓が限られた再生能力を持っているので、自家心臓移植は、直接失わ機能的な心臓組織を補充を目的とした、現在臨床的に認められ治療法です。ドナー心臓および長期免疫抑制療法の必要性の限られた数を含む、心臓移植の重大な欠点は、この治療法の普及の使用を排除する。その結果、薬物療法では、心疾患患者の治療の主力となっている。医薬品開発における主要な課題は正確にin vitroで正常と病的心筋の生理を繰り返す細胞アッセイの識別である。
幹細胞生物学と組織工学技術の最近の収束は、心臓再生のための新しい有望な道を発生させます。再生可能な患者固有のソースから機能的な心筋組織を生成すると、フィールド内の主要な進歩であろう。これは、医薬品開発と発見のための疾患特異的な細胞アッセイの開発が可能になると心臓の再生医療のための基礎を築くだろう。ヒト胚性幹細胞（ES細胞）と、もっと重要なのは、人間の人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、心室前駆細胞および成熟した心室筋細胞の潜在的に再生可能な患者固有のソースを表します。幹細胞生物学と組織工学戦略の組み合わせでは、創薬のためか、進行した心不全の治療のための心臓再生のアプローチにおける細胞アッセイの開発に使用することができるin vitroで機能的な心臓組織を生成することで、この問題に対処しています。
_content ">心臓再生における中心的な課題は、最適な細胞タイプの同定されています。様々なソースから異なる多能性心臓前駆体が発見されているものの、細胞の広い配列が、しかし、今日まで、細胞の識別を1に研究されているこのような筋原細胞の運命へのコミットメントなどの重要な要件を満たしているソースは、機能的な心筋組織へのin vivoまたは in vitroおよび組成の展開する能力を維持することは、中心的な問題であることが証明された2。我々は以前に二重トランスジェニックマウス系を記載しているそれは非常にin vitroで分化したES細胞から、コミットされた心室性前駆細胞の集団（CVP）を精製単離を可能にします私たちはMEF2C遺伝子のISL1依存エンハンサーの制御下のDsRed赤色蛍光タンパク質を発現する新規な二重トランスジェニックマウスを作製し、の制御下で増強された緑色蛍光タンパク質心臓特異的エンハンサーNkx2.5。この2色の蛍光レポーターシステム、MEF2CとNkx2.5遺伝子の発現に応じて蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて単離することができる開発ES細胞からの第一及び第二の心臓フィールド前駆細胞に基づく。 CVPは、心臓組織の再生を目的とした偉大な約束を提供しています何の心筋マーカーとの構造的および機能的な資質3の発現パターンに基づいて、心筋細胞に似ている。組織工学の分野における多くの進歩があったが、ネイティブの細胞構造を模倣することは重要な課題として残されている。この課題に対処するための従来の方法は 、in vitro での細胞と播種生物学的または合成足場が含まれています。急速な分解、限られた物理的および機械的安定性と低細胞密度1,4,5含む足場、の多くの欠点のために、我々は足場のない組織を設計しようとしました。 Altキーハフ心臓の細胞が細胞外マトリックスタンパク質の分泌によってそれらの局所微小環境を変更することができ、それらは細胞外手がかりがない状態で棒状の心筋細胞に自分自身を整理するための、より限られた能力を持っている。このように、機能的な心筋組織を構成する細胞は、適切な空間および生物学的な手がかりを提供するテンプレートが必要です。マイクロコンタクトプリントは、正確に位置合わせ機能心筋組織の生成のために重要であるすべては細胞の形状、組織、機能6-8を 、制御するための簡単かつ安価な手法を提供することにより、この課題に対応します。それは正確なパターンで、PDMS基板上に細胞外マトリックスタンパク質の沈着を有効にしてこのように空間的に細胞接着に影響を与えることが2μm9に至るまで、機能·サイズの微小構造のポリジメチルシロキサン（PDMS）スタンプの使用を含む。
ここで、我々は、幹CELで組織生体工学技術を組み合わせることを提案するlは生物学異方性、機能心筋組織を生成する。したがって、我々はここで、次のための私達の最近出版されたアプローチを示す：（1）境界の心筋組織のためのテンプレートを生成するためのマイクロコンタクトプリンティングによるPDMS基板上にマイクロパターンタンパク質表面の生成（2）高から心臓前駆細胞の精製分離ES細胞は 、in vitro で分化、および（3）の両方の技術の組み合わせは、整列機能的な心筋組織を生成する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、我々は彼らが整列し、心筋細胞のようなロッド形状を取ることができますどのような心原性前駆細胞の精製された集団を区別し、フィブロネクチンマイクロパターン基板上シードそれらをするための方法を提示した。正常な細胞組織は、心筋組織のために、特に、正常な組織機能8,10のために重要です。心筋細胞は、異方性セル·アレイを形成する際に、11,13 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ナノシステム研究センター（CNS）、無のNSF賞の下で国立科学財団によってサポートされている国家ナノテクノロジー基盤ネットワーク（NNIN）のメンバーで、一部で実施された。 ECS-0335765。 CNSは、ハーバード大学の一部である。
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
Referências
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