Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken
Summary
Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.
Abstract
Fortgeschrittener Herzinsuffizienz stellt eine große Herausforderung unerfüllten klinischen, die aus dem Verlust von lebensfähigen und / oder voll funktionsfähige Herzmuskelzellen. Trotz optimaler medikamentöser Therapie stellt Herzinsuffizienz eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der entwickelten Welt. Eine große Herausforderung in der Arzneimittelentwicklung ist die Identifizierung von zellulären Assays, die genau rekapitulieren normalen und erkrankten menschlichen Physiologie myokardialen in vitro. Ebenso sind die großen Herausforderungen in der regenerativen Biologie kardialer um die Identifizierung und Isolierung von Patienten-spezifischen kardialen Vorläuferzellen in klinisch relevanten Mengen zu drehen. Diese Zellen haben, um dann in funktionelle Gewebe, das die native Herzgewebe Architektur. Mikrokontaktdruck ermöglicht die Erstellung von präzisen mikrostrukturierten Protein Formen, die strukturelle Organisation des Herzens ähneln ähnelt montiert werden, wodurch geometrische Hinweise auf Zelladhäsion räumlich steuern. Hierinbeschreiben wir unserem Ansatz zur Isolierung von hochreinem Herzmuskelzellen aus pluripotenten Stammzellen in vitro Differenzierung, die Erzeugung von Zellwachstum Oberflächen mit Proteinen der extrazellulären Matrix mit Mikrostruktur und die Montage der Stammzellen abgeleiteten Herzmuskelzellen in anisotropen Myokardgewebe.
Introduction
Trotz der jüngsten Fortschritte in der medizinischen Therapie, bleibt fortgeschrittener Herzinsuffizienz eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der entwickelten Welt. Das klinische Syndrom ergibt sich aus einem Verlust von funktionalen Herzmuskelgewebe und anschließend die Unfähigkeit des versagenden Herzens, um die metabolischen Anforderungen der Betroffenen gerecht zu werden. Da das Herz hat eine begrenzte Regenerationsfähigkeit ist autologen Herztransplantation die einzige aktuelle klinisch anerkannte Therapie direkt am Auffüllen verloren funktionale Herzgewebe ab. Signifikante Nachteile der Herztransplantation, einschließlich einer begrenzten Anzahl von Spenderherzen und die Notwendigkeit für eine langfristige Immunsuppressionstherapie, schließt die weit verbreitete Verwendung dieser Therapie. Als Ergebnis hat die medizinische Therapie die Hauptstütze der Behandlung von Patienten mit Herzerkrankungen. Eine große Herausforderung in der Arzneimittelentwicklung ist die Identifizierung von zellulären Assays, die genau rekapitulieren normalen und erkrankten Myokards Physiologie in vitro.
Die jüngste Annäherung der Stammzellbiologie und Tissue Engineering Technologie wirft neue, viel versprechende Wege zur kardialen Regeneration. Erzeugung funktioneller Myokardgewebe aus erneuerbaren Patienten-spezifische Quelle wäre ein großer Fortschritt auf dem Gebiet sein. Dies würde bei der Entwicklung der Krankheit spezifische zelluläre Assays zur Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln ermöglichen und die Grundlage für kardiale Regenerationsmedizin lag. Menschliche embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und mehr deutlich, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) stellen eine potenziell erneuerbaren Patienten-spezifischen Quelle der ventrikulären Vorläuferzellen und reife ventrikulären Myozyten. Die Kombination von Stammzellbiologie und Tissue Engineering Strategien löst dieses Problem durch Erzeugen funktionelle Herzgewebe in vitro, die in der Entwicklung von zellulären Assays für die Wirkstoffentwicklung oder in kardialen regenerativen Ansätzen zur Behandlung fortgeschrittener Herzinsuffizienz verwendet werden können.
_CONTENT "> Eine zentrale Herausforderung kardiale Regeneration ist seit der Identifizierung einer optimalen Zelltyp. Eine Vielzahl von Zellen wurden 1 untersucht jedoch bisher, obwohl verschiedene multipotenten Vorläufern kardiogenen aus verschiedenen Quellen haben entdeckt worden, die eine Identifizierung einer Zelle Quelle, die kritischen Anforderungen wie Einsatz für die myogenen Zellschicksals erfüllt hat Erhaltung der Kapazität, um in vivo oder in vitro und Zusammensetzung an eine funktionelle Myokardgewebe erweitern sich als zentrales Problem 2 sein. Wir haben zuvor eine doppelt transgenen Maus beschriebene System das ermöglicht die Isolierung von hoch gereinigten Populationen von Vorläuferzellen engagierten ventrikulären (CVP) aus ES-Zellen differenzierenden in vitro. Wir erzeugten eine neuartige doppelt transgenen Maus, die den roten fluoreszierenden Proteins DsRed exprimiert unter der Kontrolle eines ISL1-abhängigen Enhancer des Gens und MEF2C das verstärkt grün fluoreszierende Protein unter der Kontrolledie herz-spezifische Nkx2.5 Enhancer. Basierend auf dieser zweifarbige Fluoreszenz-Reporter-Systems, einen ersten und zweiten in das Herz Feld Vorläuferzellen aus Entwicklungs-ES-Zellen kann mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) nach ihrer Expression MEF2C und Nkx2.5 Gene isoliert werden. CVP ähneln Herzmuskelzellen auf den Expressionsmuster der myokardialen Marker und strukturellen und funktionellen Eigenschaften 3, was sehr vielversprechend für Herzgewebe regenerative Zwecke bietet basiert.Zwar gab es viele Fortschritte auf dem Gebiet des Tissue Engineering, imitiert nativen zellulären Architektur bleibt eine zentrale Herausforderung. Herkömmliche Methoden zur Bewältigung dieser Herausforderung sind Aussaat biologischen oder synthetischen Gerüsten mit Zellen in vitro. Aufgrund einer Reihe von Nachteilen von Gerüsten, einschließlich schnellen Abbau, begrenzte physikalische und mechanische Stabilität und geringe Zelldichte 1,4,5, haben wir versucht, Gerüst-weniger Gewebe zu konstruieren. Although Herzzellen ihre lokalen Mikroumgebung durch die Sekretion von extrazellulären Matrix-Proteinen verändern, haben sie eine weitere begrenzte Kapazität haben, um stabförmigen kardialen Myozyten in Abwesenheit von extrazelluläre Signale anzuordnen. Somit wird eine Vorlage, die Zellen und biologische entsprechenden räumlichen Hinweise auf funktionelle Myokardgewebe komponieren bietet erforderlich. Mikrokontaktdrucken dieser Herausforderung durch die Bereitstellung eines einfachen und kostengünstigen Technik zur präzisen Steuerung Zellform, Organisation und Funktion 6-8, die alle entscheidend für die Erzeugung von funktionellen Myokardgewebe ausgerichtet sind. Es umfasst die Verwendung von mikrotexturierte Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel mit Strukturgrößen im Bereich bis zu 2 um 9, die die Ablagerung von Proteinen der extrazellulären Matrix auf PDMS Substrate präzise Muster ermöglichen und damit zu Zelladhäsion räumlich beeinflussen.
Hier schlagen wir vor, Gewebe Bioengineering-Technologie mit Stiel cel kombinierenl Biologie zu generieren anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe. Dementsprechend wir hier zeigen unsere kürzlich veröffentlichten Ansatz für die folgenden: (1) die Erzeugung von mikrostrukturierten Oberflächen-Protein auf PDMS Substraten durch Mikrokontaktdrucken zur Erzeugung einer Schablone für ausgerichteten Herzmuskelgewebe, (2) die Isolierung hochreiner kardialen Vorläuferzellen aus ES-Zellen in vitro Differenzierung und (3) die Kombination der beiden Techniken zur Erzeugung von funktionellen Myokardgewebe ausgerichtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll stellten wir ein Verfahren, um gereinigte Populationen von kardiogenen Vorläuferzellen zu isolieren und sie auf Saatgut mikrostrukturierten Substrate Fibronectin was ermöglicht sie auszurichten und einen Kardiomyozyten-ähnliche Stabform. Normale zelluläre Organisation ist kritisch für normales Gewebe Funktion 8,10, insbesondere zum Myokardgewebe. Herzmuskelzellen Es wurde gezeigt, verbesserte mechanische 11,12 und 11,13 elektrophysiologischen Eigenschaften zu ent…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde zum Teil am Center for Nanoscale Systems (ZNS), ein Mitglied der National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), die von der National Science Foundation unter NSF Award nicht unterstützt wird durchgeführt. ECS-0335765. CNS ist Teil der Harvard University.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
Referências
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