Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi
Summary
Hizalanmış miyokard doku nesil klinik açıdan yararlı amaçlar için kök hücre biyolojisi ile ilgili güncel gelişmeleri adapte için önemli bir gerekliliktir. Bu yazıda hücre şekli ve fonksiyonu hassas kontrolü için mikrokontak baskı yaklaşımı açıklar. Kardiyak progenitörler türetilmiş embriyonik kök hücre son derece saf popülasyonlarının kullanarak, biz sonra anizotropik fonksiyonel miyokard doku oluşturur.
Abstract
İleri kalp yetmezliği uygulanabilir ve / veya tamamen fonksiyonel kalp kası hücrelerinin kaybından kaynaklanan, büyük karşılanmamış klinik sorun teşkil etmektedir. Optimum ilaç tedavisine rağmen kalp yetersizliği gelişmiş dünyada morbidite ve mortalitenin önde gelen nedenidir temsil eder. Ilaç geliştirilmesinde önemli bir meydan okuma doğru vitro normal ve hastalıklı insan miyokard fizyolojisi recapitulate hücresel testlerinin tanımlanmasıdır. Aynı şekilde, rejeneratif kalp biyolojideki başlıca zorlukları klinik miktarlarda hasta-spesifik kardiyak progenitörlerin tespiti ve izolasyonu etrafında döner. Bu hücreler daha sonra böylece mekansal hücre yapışması kontrol geometrik ipuçları veren,. Mikrokontak baskı kalbinin yapısal organizasyonu benzer hassas micropatterned protein şekillerin oluşturulmasını sağlar yerli kalp dokusu mimarisi benzer fonksiyonel doku içine monte edilmelidir. Buradabiz çok in vitro, ekstrasellüler matriks proteinleri ile micropatterned hücre büyümesi yüzeylerin nesil ayırt pluripotent kök hücrelerinden miyokard hücreleri arıtılmış izolasyonu için bizim yaklaşımımız açıklamak ve anizotropik miyokard dokusu içine kök hücre kökenli kalp kası hücrelerinin montajı.
Introduction
Medikal tedavideki gelişmelere rağmen, ileri kalp yetmezliği gelişmiş dünyada mortalite ve morbiditenin önde gelen nedenidir. Klinik sendrom fonksiyonel miyokard doku kaybı ve etkilenen bireylerin metabolik ihtiyaçları karşılamak için başarısız kalp sonradan bir yetersizlik ortaya çıkar. Kalp sınırlı yenilenme kapasitesi olduğundan, otolog kalp nakli doğrudan kaybetti işlevsel kalp dokusu yenilenmesi hedefleniyor sadece mevcut klinik kabul tedavisidir. Donör kalpleri sınırlı sayıda ve uzun süreli immünosupresif tedavi için, bu tedavinin yaygın kullanılmasına engel ihtiyacı da dahil olmak üzere kalp nakli önemli sakıncaları. Sonuç olarak, tıbbi tedavi kalp hastalığı olan hastalar için tedavi dayanak noktası olmuştur. Ilaç geliştirilmesinde önemli bir meydan okuma doğru vitro normal ve hastalıklı miyokard fizyolojisi recapitulate hücresel testlerinin tanımlanmasıdır.
Kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği teknolojinin son yakınsama kardiyak rejenerasyon için yeni umut verici yollar yükseltir. Yenilenebilir bir hastaya özgü kaynak işlevsel miyokard dokusu oluşturuluyor alanında önemli bir ilerleme olacaktır. Bu ilaç geliştirme ve keşif için hastalığa spesifik hücresel testlerin geliştirilmesi için izin verecek ve kardiyak rejeneratif tıp için temellerini atacak. İnsan embriyonik kök (ES) hücreler ve, daha da önemlisi, insan kaynaklı pluripotent kök (iPS) hücreler ventriküler progenitör hücreler ve olgun ventriküler miyositlerin potansiyel yenilenebilir hastaya özgü kaynağı temsil eder. Stem hücre biyolojisi ve doku mühendisliği yöntemi kombinasyonu ilaç keşfi için veya ileri kalp yetmezliğinin tedavisi için kalp rejeneratif yaklaşımlar hücre testlerin geliştirilmesinde kullanılabilecek in vitro fonksiyonel kalp dokusu oluşturularak bu sorunu ortadan kaldırır.
_content "> kardiyak rejenerasyon olarak merkezi bir meydan okuma optimal hücre tipinin belirlenmesi olmuştur. çeşitli kaynaklardan farklı multipotent kardiyojenik öncüleri keşfedilmiş olmasına rağmen hücrelerin geniş bir dizi, bununla birlikte, şimdiye kadar, bir hücre kimlik 1 incelenmiştir Böyle miyojenik hücre kaderinin bağlılık gibi kritik gereksinimlerini karşılayan kaynak, fonksiyonel miyokard dokusunun in vivo ya da in vitro ve kompozisyon genişletmek için kapasite bakım merkezi bir sorunu 2 olduğu kanıtlanmıştır. Biz daha önce bir çift transgenik fare sistemi nitelendirdiler Bu son derece in vitro farklılaşan ES hücrelerinin kararlı ventriküler öncü hücrelerden (CVP) popülasyonlarının saflaştırılmış izolasyon sağlar. Bu MEF2c geninin bir Isl1-bağımlı artırıcı madde kontrolü altında DsRed kırmızı flöresanlı protein ifade eden yeni bir çift transgenik fare oluşturulur ve denetimi altında geliştirilmiş bir yeşil floresan proteinkardiyak spesifik Nkx2.5 arttırıcı. Bu iki-renkli flüoresan raportör sistemi, MEF2c ve Nkx2.5 genlerin kendi ifade göre Flüoresans Aktif hücre sıralama (FACS) vasıtasıyla izole edilebilir, gelişmekte olan ES hücreleri geçen ilk ve ikinci kalp alan öncüllerinden esas alınmıştır. CVP kardiyak doku rejeneratif amaçlı büyük umut sunduklarıyla miyokard belirteçler ve yapısal ve işlevsel özellikleri, 3, ifade şekillerine göre kardiyak miyositler benzerler.Doku mühendisliği alanında birçok gelişmeler olmuştur rağmen, yerel hücresel mimarisini taklit önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Bu sorunu gidermek için geleneksel yöntemler Vitro hücreleri ile tohum, biyolojik veya sentetik iskeleleri bulunmaktadır. Hızla bozulması, sınırlı fiziksel ve mekanik stabilite ve düşük hücre yoğunluğu 1,4,5 gibi iskeleleri, dezavantajları bir dizi nedeniyle, iskele-az doku mühendisi çalışmışlardır. AltHough kalp hücrelerinin ekstrasellüler matriks proteinlerinin salgılanması ile kendi yerel mikroçevrede değiştirebilir, onlar ekstraselüler ipuçlarının yokluğunda çubuk şekilli kardiyak miyositler için kendilerini organize etmek için daha sınırlı bir kapasiteye sahiptir. Böylece, fonksiyonel miyokard dokusu oluşturmak için hücreleri uygun mekansal ve biyolojik ipuçları sağlayan bir şablon gereklidir. Mikrokontak baskı hassas hizalanmış fonksiyonel miyokard doku üretimi için önemli olan her hangi hücre şekli, organizasyon ve fonksiyonu 6-8, kontrol etmek için basit ve ucuz bir yöntem sağlayarak bu sorunu giderir. Bu, hassas kalıplar içinde PDMS substratlar üzerine hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi sağlamak ve böylece mekansal olarak hücre yapışma etkiler 2 um ile 9 arasında değişen aşağı özelliği boyutlarına sahip Mikrodokulu polidimetilsiloksan (PDMS) mühür kullanımını kapsamaktadır.
Bu yazıda, kök cel ile doku biyomühendislik teknolojisi birleştirmek teklifl biyoloji anizotropik fonksiyonel miyokard dokusu oluşturmak için. Buna göre, biz burada şu bizim son zamanlarda yayınlanan bir yaklaşım göstermektedir: (1) hizalanmış miyokard dokusu için bir şablon nesil için mikrokontak baskı ile PDMS yüzeylerde micropatterned protein yüzeylerin nesil (2) Şiddetle gelen kardiyak progenitörlerin saflaştırılmış izolasyonu ES hücreleri in vitro farklılaşan, ve (3) oluşturmak için iki tekniği kombinasyon fonksiyonel miyokardiyal doku hizalanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde, biz onları hizalamak ve bir kardiyak miyosit benzeri çubuk şekil almaya izin verir ne kardiyojenik progenitörlerinin saflaştırılmış popülasyonları ayırmak ve micropatterned Fibronektin yüzeylerde tohum onları için bir yöntem sundu. Normal hücresel organizasyonu miyokard dokusunun özellikle normal doku fonksiyonu 8,10 için kritik öneme sahiptir. Kardiyak miyositlerin anizotropik hücre dizileri oluştururken geliştirilmiş mekanik 11,12 ve elektrofizyolojik özell…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Nanoseviye Sistemleri Merkezi (MSS), hiçbir NSF ödül kapsamında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen Ulusal Nanoteknoloji Altyapı Ağı (NNIN), bir üyesi azından kısmen yapıldı. ECS-0335765. MSS Harvard Üniversitesi'nden bir parçasıdır.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
Referências
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
