Aislamiento, cultivo y caracterización funcional de ratón adulto Cardiomyoctyes

Summary

Aquí se describe el aislamiento de cardiomyoctyes adultas de ratón utilizando un sistema de perfusión Langendorff. Las células resultantes son de Ca2 +-tolerante, eléctricamente en reposo y pueden ser cultivadas y transfectadas con adeno-o lentivirus para manipular la expresión génica. Su funcionalidad también puede ser analizado usando el sistema de MMSYS y técnicas de patch clamp.

Abstract

El uso de los cardiomiocitos primarios (CM) en la cultura ha proporcionado un poderoso complemento de los modelos murinos de enfermedad cardíaca en el avance de nuestra comprensión de las enfermedades del corazón. En particular, la capacidad para estudiar la homeostasis de iones, la función del canal de iones, la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción y sus alteraciones en condiciones de enfermedad y por mutaciones causantes de enfermedades han conducido a una mejor aproximación a las enfermedades cardíacas. Por otra parte, la falta de una línea celular inmortalizada adecuada para imitar adultos CM, y las limitaciones de los CM neonatal (que carecen de muchas de las biomecánica característica estructural y funcional de los adultos CM) en la cultura han dificultado la comprensión de la compleja interacción entre las vías de señalización, canales iónicos y las propiedades contráctiles del corazón adulto fortalecer la importancia del estudio de cardiomiocitos adultos aislados. A continuación, presentamos los métodos para el aislamiento, cultivo, manipulación de la expresión génica mediante adenovirus-expreproteínas ssed, y posterior análisis funcional de los cardiomiocitos de ratón adulto. El uso de estas técnicas ayudará a desarrollar una visión mecanicista en las vías de señalización que regulan la excitabilidad celular, Ca ^{2 +} dinámica y la contractilidad y ofrecer una caracterización mucho más fisiológicamente relevantes de la enfermedad cardiovascular.

Introduction

Los modelos murinos de enfermedad cardiovascular han servido como herramientas eficaces para la aclaración de los mecanismos fundamentales de la enfermedad ^1,2, así como para la identificación de dianas terapéuticas potenciales ^1,3. En particular, el uso de ambos modelos murinos de enfermedad cardíaca adquirida (tales como presión de la sobrecarga) ^4,5 y modelos de ratones transgénicos han avanzado nuestra comprensión de la enfermedad cardíaca ^6-8. El uso de técnicas de cultivo celular para estudiar las cascadas de señalización ^3,9,10 y alteraciones en las proteínas individuales que subyacen en la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el corazón ^11-13 en el nivel de la célula individual han complementado los in vivo en modelos de ratón. Sin embargo, la falta de líneas celulares adecuadas que reflejan la estructura y función CM adultos ha sido una limitación significativa. Los investigadores han intentado superar esta mediante el estudio de proteínas individuales, tales como canales de iones, en sistemas de expresión heterólogos <sup> 14, y si bien estos estudios nos han proporcionado información útil en términos de la biofísica de los canales iónicos o el tráfico de proteínas, la representación inadecuada del microambiente natural de los CM es una limitación importante. En segundo lugar, ya que la mayoría de estas células heterólogas no tienen un aparato contráctil madura, no ha sido posible estudiar la función contráctil y la compleja interacción entre la excitabilidad celular y la contracción. Por esta razón, los investigadores han recurrido a los cultivos de células cardíacas primarias para muchos de sus estudios funcionales in vitro. Por último, los estudios de cardiomiocitos aislados permiten la evaluación de la función contráctil sin los factores de confusión de preparación multicelular, incluyendo el efecto de la cicatriz o fibrosis y orientación de la fibra.

Cardiomiocitos ventriculares de rata neonatales primarios (NRVMs) son relativamente fáciles de cultivar, pueden ser infectados con adenovirus y lentivirus de manipular la expresión génica ^15, unapor lo tanto, ND se han utilizado con éxito ^1, pero tienen limitaciones de su propia. A pesar de que proporcionan un microambiente fisiológico ¹ y han sido el caballo de batalla del campo de la señalización, las diferencias sustanciales entre la morfología y la organización subcelular de NRVMs y cardiomyoctyes adultos les hacen un modelo inadecuado para la investigación de los flujos iónicos y acoplamiento excitación-contracción en el corazón adulto . Más notablemente NRVMs carecen de un-t tubular subsistema definitiva ^4. Desde Ca ^{2 +} flujo y la dinámica son críticamente dependientes madura t-tubular y retículo sarcoplásmico (SR) Estructura ^6, Ca ^{2 +} y la dinámica de los estudios funcionales de la contractilidad cardíaca en NRVMs no son un reflejo exacto de estos procesos críticos en cardiomiocitos adultos. Además, algunos componentes de las vías de señalización diferentes entre ratones recién nacidos y adultos ^9, proporcionando así otra limitación para el estudio de los procesos de enfermedad y de su impact en la excitabilidad celular y la contractilidad en NRVMs. Finalmente, la distribución de la maquinaria contráctil conduce a multidireccional y no uniforme acortamiento celular limitar la exactitud de las mediciones contráctiles.

El uso de aislados cardiomiocitos adultos ofrece, por tanto, un sistema de modelado más preciso in vitro. El extraordinario crecimiento del conocimiento posible gracias a la manipulación genética de los ratones subraya la importancia de la obtención de cardiomiocitos aislados funcionales de los ratones. De hecho, la caracterización de los CM adultas aisladas de modelos de ratón ha arrojado luz sobre muchos eventos biológicos y patológicos. CM aisladas de modelos de ratones transgénicos han permitido estudios de la ganancia o pérdida de la función de las proteínas en las propiedades contráctiles de las células individuales ^2,16, y la viabilidad de modelos de enfermedades, como la isquemia / reperfusión ^17,18, complementando así la información obtenida a partir de Estudios in vivo sobre lalos ratones se. El uso de aislados adultos CM de modelos murinos de enfermedad cardiaca adquirida ^3,19,20 (como transversal sobrecarga de presión inducida por la constricción aórtica, que imita la hipertensión o estenosis de la válvula aórtica) o el ejercicio ^5,21 (para el modelado de la hipertrofia fisiológica) permite un examen de la interacción de las cascadas de señalización implicadas en estos procesos con la excitabilidad celular y el acoplamiento excitación-contracción en el nivel de la célula individual. Además, la capacidad de manipular la expresión génica utilizando la expresión génica adenoviral impulsada en adultos CM nos proporciona la oportunidad de diseccionar los componentes de las vías de señalización complejos.

Desde una perspectiva electrofisiológico, voltaje de células enteras y los experimentos de fijación actuales en aislados adulto CM han sido fundamentales en el esclarecimiento de la naturaleza de los flujos iónicos al inicio del estudio y en varios estados de la enfermedad. Debido a la compleja estructura de la membrana celular y la protección de bi diferencialen las estructuras de andamiaje entre el adulto y los CM NRVMs o líneas celulares heterólogos, la capacidad para reparar las células adultas da una mejor representación de los efectos de ciertas proteínas de membrana, proteínas estructurales, y socios de canales iónicos que interactúan sobre los componentes electrofisiológicas del corazón adulto.

A pesar de estas ventajas importantes en el estudio de adultos cardiomiocitos murinos, aislamiento y cultivo de cardiomiocitos ratones adultos ha sido un reto, instando a la necesidad de una descripción sistemática y precisa de la metodología para aislar cardiomiocitos viables de ratón y de mantenerlas en cultivo para permitir su posterior manipulación genética utilizando viral vectores. Estudios previos han utilizado ya sea de forma aguda aislada de ratón adulto CM o cultivados de rata adulta CM. Estos últimos son más fáciles de cultivar que los CM ratón adulto, y la mayoría de los experimentos de manipulación de la expresión génica in vitro han utilizado ratas adultas CM. Pocos estudios se han alterado con éxito e investigado functila expresión de genes onal en ratón adulto CM, presentando una gran limitación en el alcance de los experimentos. Por lo tanto, aquí presentamos en detalle tales metodologías, modificado a partir de investigaciones anteriores, para el aislamiento ^7,8,22, cultura ^3,10,15,23, infección adenoviral ^11-13,15, y el análisis funcional de cardiomyoctyes ventriculares de ratón adulto. Este protocolo de aislamiento resultados en Ca ^{2 +,} cardiomiocitos excitables tolerantes que tenemos cultivadas con éxito durante un máximo de 72 horas y transitoriamente transfectadas con adenovirus. La funcionalidad de estas células aisladas se puede evaluar utilizando el sistema de imágenes MMSYS ^14,24 y de patch clamp, que también será discutido.

Protocol

1. El aislamiento de los cardiomiocitos Materiales (figura 1) Microdissecting fórceps Fórceps del tejido Pinzas hemostáticas Delicadas Pinzas hemostáticas Microdissecting, dentadas, pinzas curvas Tijeras de funcionamiento, recto Tijeras de funcionamiento, curvado 15 ml tubos Falcon (5) 60 mm placa de Petri Tampón fosfato salino (PBS) Nylon Mesh – tamaño de poro de 400 micra…

Representative Results

El aislamiento de los adultos cardiomyoctyes resultados en las células en forma de barra, estriados y de reposo (no de forma espontánea de latir) (Figura 5A). Las células muertas se verá redondeado y sin estrías estarán presentes. Las células quiescentes pueden ser cultivadas y transfectadas con adenovirus para manipular la expresión génica (figuras 5B y 5C). Después de 24 horas de cultivo, la morfología de las células vivas no cambia, siguen siendo Ca …

Discussion

En este informe, hemos descrito las técnicas necesarias para el éxito en el aislamiento y la cultura de los adultos los CM del corazón de ratón. Nuestra técnica permite para el estudio posterior de la función de CM y la excitabilidad usando los métodos descritos anteriormente. El parámetro crítico para el estudio de la funcionalidad de adultos CM es la salud y la calidad de los CM aislado. Como se describió anteriormente, nuestras técnicas permiten un alto rendimiento de células funcionales que son susceptib…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Chloride	Sigma	S7653
Potassium Chloride	Sigma	P9333
Magnesium Chloride	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S8282
D-glucose minimum	Sigma	G8270
Taurine	Sigma	T0625
2,3-Butanedione monoxime	Sigma	B0752
Collagenase B	Roche Applied Science	11088807001
Collagenase D	Roche Applied Science	11088858001
Protease XIV from Streptomyces griseus	Sigma	P5147
Albumin from Bovine Serum	Sigma	A2153
Calcium Chloride	Sigma	C8106
Minimum Essential Media	Sigma	51411C
Albumin solution from bovine serum	Sigma	A8412
L-glutamine	Sigma	G3126
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement	Sigma	I1884
Cesium Chloride	Sigma	289329
Glutamate	Sigma	G3291
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid	Sigma	E3889
Cesium Hydroxide Solution	Sigma	232041
Tetraethylammonium hydroxide solution	Sigma	86643
OptiVisor optical glass binocular visor	Dohegan Optical Company Inc.	N/A
Tissue forceps, 5.5″, 1×2 teeth	Roboz Scientific	RS-8164
Moloney forceps – 4.5″ (11.5 cm) long slight curve, serrated	Roboz Scientific	RS-8254
Dumont #3 Forceps, Dumostar, tip size 0.17 x 0.10mm	Roboz Scientific	RS-4966
Packer Mosquito Forceps 5″ Straight Flat	Roboz Scientific	RS-7114
Micro Dissecting Scissors 4.5″ Curved Sharp/Sharp	Roboz Scientific	RS-5917
Micro Dissecting Scissors 3.5″ Straight Sharp/Sharp20mm	Roboz Scientific	RS-5907