Den senaste tidens utveckling i neurovetenskap verktyg som kombinerar genetik och optik, benämnd "optogenetics", möjliggör kontroll över neural krets aktivitet med en oöverträffad nivå av tidsmässiga och geografiska. Här ger vi ett protokoll för att integrera in vivo-inspelning med optogenetic manipulation av genetiskt definierade undergrupper av prefrontala kortikala och subicular pyramidala nervceller.
Optogenetic metoder har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att belysa neural krets aktivitet som ligger bakom en mångfald av beteenden inom ett brett spektrum av arter. Optogenetic bearbetar av mikrobiellt ursprung består av ljuskänsliga membranproteiner som är i stånd att aktivera (t.ex. channelrhodopsin-2, ChR2) eller tystnad (t.ex. halorhodopsin, NpHR) neural aktivitet ingenetically definierade celltyper över behaviorally-relevanta tidsskalor. Vi visar först en enkel metod för adeno-associerat virus-förmedlad leverans av ChR2 och NpHR transgener till den dorsala subiculum och prelimbic regionen hos prefrontala cortex i råtta. Eftersom ChR2 och NpHR är genetiskt inriktningsbar beskriver vi användandet av denna teknik för att styra den elektriska aktiviteten i specifika populationer av nervceller (dvs pyramidala neuroner) inbäddade i heterogena vävnad med hög tidsmässig precision. Vi beskriver häri hårdvara, anpassade programanvändargränssnitt, och rutiner som möjliggör samtidig ljus leverans och elektrisk inspelning från omvandlade pyramidala nervceller i en bedövad in vivo-förberedelser. Dessa ljus lyhörd verktyg ger möjlighet till att identifiera de kausala bidrag av olika celltyper till behandling och beteendeinformation.
Förmågan att aktivera eller tysta en viss celltyp i en neural krets i en tidsmässigt exakt sätt är avgörande för att förstå hur nervbanor bearbetar olika typer av information underliggande känslor och kognition. Experimentell kontroll över intakt neural aktivitet har anställt loss-/gain-of-function verktyg (t.ex. elektrisk stimulering, farmakologisk modulering, skada) som inte ger önskad selektivt för att styra specifika populationer av nervceller, antingen på en temporal eller rumslig skala. Direkt ta itu med dessa tekniska utmaningar, har utvecklingen och tillämpningen av genetiskt-kodningsbara ljuskänsliga verktyg aktiverade neuroforskare för att styra den elektriska aktiviteten i utvalda celltyper under väldefinierade beteende händelser. Många av dessa ljuskänsliga proteiner är av mikrobiellt ursprung, med ljuskänsliga katjon kanal channelrhodopsin-2 (ChR2) 1, och den ljusdrivna klorid pump, halorhodopsin (NpHR) 2,3, används i begränsad omfattning.
En stor fördel med optogenetics är förmågan att genetiskt-målgruppspecifika cellpopulationer i heterogena områden i hjärnan och tekniken har med framgång tillämpats på ett antal modellorganismer (ryggradslösa djur till icke-mänskliga primater) 4-6. Har genererats och finns kommersiellt tillgängliga 7,8 Många optogenetic transgena djur emellertid upprättandet transgena linjerna kan vara arbetsintensiv och kostnaden avskräckande. Här beskriver vi ett protokoll för viralt förmedlad leverans av ChR2 och NpHR gener under CaMKIIα promotorn i råtta prelimbic cortex och dorsala subiculum användning av ett rekombinant adeno-associerat virus (AAV)-vektor. Inom framhjärnan, är CaMKIIα uttryck exklusivt för glutamaterg pyramidala nervceller 9. AAV är vanligen används för grundforskning på grund av dess relativt lätta att framställa och avsaknaden av patogenicitet, liksom den starka och PERSIstent transgenuttryck som har uppnåtts med dessa vektorer 10. Utöver detta vill vi beskriva stegen och hårdvara för samtidig ljus leverans och inspelning i sövda huvud fixerade råttor.
Ett brett spektrum av tekniker finns tillgängliga för genetiskt inriktning mikrobiella opsin gener till diskreta hjärnregioner hos gnagare. Viral gen leverans ger en relativt billig och snabb metod för att förmedla ChR2 och NpHR uttryck med celltyp specificitet. AAV-vektorsystem är ett vanligt val för användning i optogenetic experiment på grund av höga produktions titrar som förblir stabil under lagring, dess avsaknad av patogenicitet och dess förmåga att producera långsiktig genuttryckning 10. Många av de opsin konstruktioner med cell-typspecifika promotorer är kommersiellt tillgängliga i en mängd olika AAV serotyper från vektor core faciliteter såsom University of Pennsylvania ( http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) eller universitetet of North Carolina i Chapel Hill ( http://genetherapy.unc.edu ). En nackdel med AAV-teknik ärbegränsad förpackningskapacitet (~ 4,7 MB), vilket innebär en begränsning av transgenen kassettstorleken som kan användas för cellspecifik inriktning. Som ett alternativ, lentivirala vektorer, som har en större förpackningskapacitet, kan ta emot opsin inriktade under kontroll av större promotorsekvenser.
Användningen av en optrode möjliggör tillförlitlig detektering av elektrofysiologiska signaler i kombination med temporalt-exakt ljusleverans. Såsom beskrivits ovan, krävs dock tillräcklig omsorg i dess konstruktion. Eftersom det kluvna optiska fibern är skör, kan binda suturtråd för hårt bringa fibern att bryta. Även om optrode kan användas för flera inspelningar, bör rengöras elektroden och den optiska fibern (eller manuellt spjälkas i fallet med den optiska fiberns nakna ände) före införande eftersom impedansen för elektroden och kvaliteten hos den levererade ljus kommer att brytas ned med upprepad användning.
Under electrophysiological inspelningar är det viktigt att optrode föras fram långsamt. Den optrode används här har ungefär 350 | im tjocklek (volframelektrod: 125 um; kärna av optisk fiber: 200 mikrometer) och sänka det snabbt kan leda till förflyttning av hjärnvävnad. Ljus-inducerade artefakter också kan anses särskilt inspelning och lätt leverans uppställningar 11-12. Även om vi hittade inga ljusinducerad artefakt i vår experimentella tillstånd, kan inspelningar utanför den omvandlade hjärnområdet potentiellt användas som en kontroll för lätta artefakter. En annan faktor under inspelningsprocessen är den önskade ljusstyrkan för att observera förändringar i ChR2-eller NpHR-uttryckande nervceller, särskilt för långvariga inspelningar. Stark laser intensitet och lång laserbelysning kan resultera i vävnadsskada och / eller en minskad respons på senare levererade ljus 12-13. För beteende experimenterande krävs användning av en kontroll virusvektor för eliminating någon effekt på grund av värmen som levereras från fibern. För många av de kommersiellt tillgängliga optogenetic konstruktioner finns det kompletterande kontroll konstruktioner där opsin gensekvens har avlägsnats.
Det bör noteras att engineered ChR2 varianter med förbättrade egenskaper och kinetik har utvecklats tillsammans med andra tysta opsins som kan vara bättre lämpade för vissa experimentella frågor 14-15. Till exempel, en ny ChR2 variant upprättas via riktad mutagenes, benämnd "Cheta", kan köra hifi-neuronala tillsatta vid frekvenser (upp till minst 200 Hz) ovanför den ursprungliga ChR2 14.
Kombinationen av in vivo-ljus leverans och samtidig inspelning av neuronala svar är ett kritiskt steg i upprättandet av orsakssamband mellan mönstrade aktivitet i genetiskt riktade cellpopulationer och motsvarande tids låsta beteende händelser. De förfaranden och hardware beskrivs här ger en enkel metod för att genomföra optogenetics för in vivo huvud-fasta inspelningar i gnagare.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institute on Drug Abuse (NIDA) bevilja R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Innovativ Seed Grant (DCC), och NIDA utbildningsstipendium T32 DA017637 (MVB).
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 μl |
Removable Needle | Hamilton | 7803-03 | 31 gauge, beveled tip |
Microinjector Pump | World Precision Instruments | UMP3 | |
Pump Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
Silicone Oil | Alfa Aesar | A12728 | |
Laser Protective Eyeware | Kentek | KMT-4501 | |
Multimode Optical Fiber | Thorlabs | BFL37-200 | 200 μm diameter core, 0.37 NA |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T12S21 | for 200 μm diameter core multimode fiber |
Optical Power Meter | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Photodetector | Newport | 818-SL/DB | |
Blue Laser (445-473 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Green Laser (532 nm, 100-200 mW) | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | coupled to a 200 μm multimode fiber with FC/PC adapter |
Tungsten/Fiber Optrode | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | Lumitrode |
Glass Capillary Tube | Fisher Scientific | 22-362-566 | |
Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MO-22 | |
Amplifier | Kation Scientific | ExAmp-20K | |
Data Acquistion Device | National Instruments | NI USB-6009 | |
Rodent Head Restraint for Recording | Lumiphy LLC | www.lumiphy.com | |
Small Animal Stereotaxic Unit | David Kopf Instruments | Model 963 |