Slice kulturer underlättar hantering av embryots utveckling genom gen och farmakologiska störningar. Dock måste odlingsbetingelser att normal utveckling kan fortsätta inom reducerad miljö skiva. Vi visar ett protokoll som underlättar normal ryggmärg utvecklingen kan fortsätta i minst 24 timmar.
Slice kulturer kan underlätta manipulering av embryots utveckling både farmakologiskt och genom gen manipulationer. I denna reducerade systemet, kan potentiella dödliga biverkningar på grund av systemiska läkemedel ansökningar övervinnas. Dock måste odlingsbetingelser se till att normal utveckling fortsätter inom den reducerade miljön i segmentet. Vi har fokuserat på utvecklingen av ryggmärgen, särskilt för spinala motorneuroner. Vi varierade systematiskt odlingsbetingelser för skivor kycklingembryon från den punkt där de flesta spinal motoriska nervceller hade fötts. Vi analyserade antalet och typen av motoriska nervceller som överlevt under kultur perioden och ställningen för de motoriska nervceller jämfört med in vivo. Vi fann att serum typ och faktorer neurotrofiska krävdes under kultur perioden och kunde hålla motoriska nervceller vid liv i minst 24 timmar och tillåta dem motoriska nervceller att migrera till lämpliga positioner iryggmärgen. Vi presenterar dessa odlingsbetingelser och metoder för att framställa kulturer embryon skiva med urtagna kycklingembryon inbäddade i agaros och skivade med en vibratome.
Under normal embryoutveckling, många olika celltyper genererades som måste migrera från sin utgångspunkt där de så småningom kommer att fungera i den mogna organismen. Inom utvecklingsländerna ryggmärgen, är progenitorceller belägna i den ventrikulära zonen vid mittlinjen och generera många subtyper av postmitotiska neuroner och gliaceller som måste migrera till integreras i funktionella neuronala kretsar som krävs för sensorisk bearbetning och utgångar motor 1. Spinal motoriska nervceller som styr sammandragning av armar muskler har studerats utförligt och mycket är känt om de molekyler och mekanismer som driver bildandet av de olika underklasser. Emellertid är mycket mindre känt genom vilka mekanismer motoriska nervceller vandrar, segregera och få synaptiska ingångar.
Motorneuron subtyp identitet förvärvas under utveckling i ett hierarkiskt sätt. Motorneuron subtyper kan grovt klassas into distinkta kolumner, divisioner och pooler som definieras av sina axon prognoser. Motor kolonner projekt axoner till antingen axiella, viscerala eller lem muskler. Motor divisioner dela benet skjuter motoriska nervceller i den laterala motorns kolumn (LMC) i de utskjutande till ventrala eller dorsala muskler 2. Inom divisionerna kallas kluster av motoriska nervceller motor pooler projekt till enskilda muskler i benet 2, 3. Limb-utskjutande motoriska nervceller definieras genom deras expression av transkriptionsfaktom Foxp1 4, 5, medan delning identitet kännetecknas av uttrycket av homeodomänen transkriptionsfaktorer Islet-1 (ventralt utskjutande) eller Lhx-1 (dorsalt utskjutande) 6. Faktum är Lhx-1-uttryck krävs för lämpliga rygg prognoser av motoriska nervceller 7. Var och en av dessa subtyper intar olika positioner inom ryggmärgen, ventrala utskjutande motoriska nervceller kommer att bo medial till dorsalt projecting motorneuroner. Detta resulterar i att LMC är uppdelade i sk LMCmedial (LMCm) och LMClateral (LMCl) divisioner. Divisional och motor pool organisation förvärvas i två faser 8. I den första fasen, är divisionschef segregering uppnås genom en vandring av motoriska nervceller i en karakteristisk medial till lateral mode. De LMCl cellerna genereras efter LMCm cellerna och så LMCl vandrar genom LMCm att uppnå sin slutliga sedimentering läge. Den andra fasen tar motoriska nervceller i en division och kluster dem i motorneuron pooler, förmodligen via en dorsal-ventral sortering av de motoriska nervceller. Medlemmar av catenin-beroende klassiska cadherin familj har visat sig vara avgörande för båda faserna av motorneuron organisation 8-10. Men hur är cadherin funktionen kontrollerar cellrörelse dåligt kända.
Förvärvet av columnar, divisions och pool identiteter kräver yttre signaler som mönster intrinsic. uttryck av transkriptionsfaktorer 11. Dessutom cirka 50% av alla motoriska nervceller dör genom apoptos under normal utveckling i en process som kräver yttre signaler från lem, till stor del genom neurotrofisk stöd motorneuron överlevnad. Således kräver motorneuron utveckling en lämplig miljö skall upprätthållas på en relativt lång tidsförloppet. Av denna anledning de praktiska generera spinal kulturer sladd skiva för att bibehålla motorneuron överlevnad kräver att klarlägga lämpliga odlingsbetingelser. Tidigare embryo slice kulturer har använts för att följa beteendet hos extrinsically lagt renade neuronala populationer 12-14. Dock har våra förutsättningar kunskaper kultur som underlättar in situ motorneuron överlevnad och migration inom segmentet själv inte publicerats. Vi ändrade en standard kultur tillstånd som underlättar överlevnaden av renat till dissocierade kraniella motoriska nervceller underlättar mOTOR neuron utveckling inom ett embryo skiva kultur-system. Vi övervakade också placeringen av de överlevande motoriska nervceller och visar att i stort sett normala positioner för motorneuron divisionerna förvärvas under odlingsperioden.
Protokollet som beskrivs här möjliggör en kycklingembryo skiva som skall inkuberas under mer än en dag och samtidigt hålla motoriska neuroner vid liv och fortsätter att migrera under odlingsperioden. Att belysa förutsättningarna för att hålla motoriska nervceller vid liv, har vi identifierat flera viktiga egenskaper som krävs. Det verkar som upp till 4% kyckling serum är avgörande för överlevnaden av motoriska nervceller och ersätts med serum från en annan art tolereras inte. Intressant nog fann vi att närvaron av högre koncentrationer av serum var till skada för skivorna som de främjade överväxt av vävnad som leder till grova störningar i segmentet formen. Ännu viktigare, visade närvaron av cilliary neurotrofisk faktor också kritisk. Det är fortfarande en distinkt möjlighet att skivorna kan kunna odlas under betydligt längre perioder än 24 timmar, kanske tillåta visualisering av sensorisk afferent insignal till ryggmärgen. Dessutom, cultida förhållanden här kan också vara användbar för att skära kulturer i utvecklingsländerna hjärnstammen och mellanhjärnan / lillhjärnan.
Kanske den största möjliga nyttan i användningen av dessa villkor skiva kultur är att de underlättar möjligheten för farmakologiska manipulation av proteiners funktion och samtidigt minimera risken för negativa effekter på resten av embryot, som hjärtat. Ett stort antal inhibitorer och agonister av olika signalvägar kan användas för att bedöma migration av olika spinal neuron subtyper och, eventuellt, deras effekt på bildningen av lokala spinal kretsar under utveckling. Dessutom kan vissa genetiska störningar av protein uttryck, såsom de som använder sig av siRNA och morfolinogrupper oligonukleotider, lider av det faktum att de bara kan införas tidigt i utvecklingen (på grund av begränsningar i in ovo elektroporation förfaranden) och effekterna bara varar en kort period av time (typiskt en dag). Vår skiva kulturen startas i senare skeden och ger möjlighet att använda denna teknik senare i utveckling på skivning skede för att visa effekterna under kultur skiva.
Segmentet kultur-protokollet kan också ge visualisering av både spinal motor neuron samt rygg interneuron migration i realtid via time-lapse video mikroskopi. Detta kan uppnås med användning av faskontrastmikroskopi under vitt ljus eller genom användning av fluorescens avbildning. Om den senare tekniken skulle användas då införandet av fluorescerande markörer behövs. Detta kan uppnås antingen genom införande av fluorescerande färgämnen såsom Dil eller DiO via antingen retrograd märkning från lemmen eller anterograd märkning från ventrikeln eller in ovo elektroporering av konstruktioner för att driva fluorescerande proteiner i en undergrupp av neuroner.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Sharon Boast för många insiktsfulla diskussioner och B. Novitch för den typ gåva antikropparna till Foxp1. Detta arbete som finansieras av en STUDENTTILLVARO från Wellcome Trust att KCT och projektbidrag från Wellcome Trust till SRP (Grant referensnummer 094399/B/10/Z).
Eggs | Henry Stewart Farms, UK | Fertilised Brown Bovan Gold Hen’s eggs (Henry Stewart Farms, UK), stored at 14 °C until incubation | |
21 Gauge needle | BD-Microlance-3 | 304432 | |
5 ml syringe | BD Plastipak | 302187 | |
#5 Dumont forceps | Roboz | RS 5045 | |
Micro Dissecting scissors | Roboz | RS 5910SC | (3.5 in straight) |
Embryo embedding moulds: Peel away moulds | Agar Scientific | G3764 | Pyramidal shaped 22 mm to 12 mm |
Super glue | Power Flex, Loctite | ||
Ethanol | SIGMA | 32221 | |
Sodium di-hydrogen Phosphate, mono-hydrate | BDH | 102454R | |
Di Sodium mono-hydrogen Phosphate | VWR/ BDH | 102494C | |
Sodium Chloride | VWR/BDH | 27810.295 | |
Low melting temperature agarose | Invitrogen | 16520 | |
Fetal Bovine serum | Gibco | 10500-064 | |
Triton X-100 | SIGMA | T8787 | |
Sodium Hydroxide | FLUKA | 71689 | |
Paraformaldehyde | VWR/BDH | 28794.295 | |
Plastic disposable pasteur pipettes | ElKay Precision laboratory consumables | 127-P503-000 | Liquipette 3 ml volume |
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14170 | |
Sucrose | SIGMA | S0389 | |
Sodium Hydrogen Carbonate | SIGMA | S5761 | |
Chicken Embryo Extract | Seralabs | CE650-J | |
Penicillin/ Streptomycin solution | Gibco | 15070 | |
L-Glutamine solution | Gibco | 25030 | |
2-mercaptoethanol | Gibco | 21985 | |
Horse serum | Southern Group Labs | 9028B | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
Neurobasal medium | Gibco | Cat ~ 2103 | |
CilliaryNeurotrophic factor (CNTF) | R and D Systems | 557-NT-010 | |
Chick Serum | SIGMA | C5405 | |
Primary antibodies | were purchased from Developmental Studies Hybridoma Bank, with the exception of anti-foxP1 antibodies, which were a kind gift from Bennett Novitch of UCLA. Primary antibodies dilutions were Rabbit anti-FoxP1 (1/32000), Mouse anti-Lhx1/2 (4F2) (1/50), Guinea Pig anti-FoxP1 (1/1000). All antibodies were stored at 4 °C. |
||
Secondary antibodies | Donkey anti-Guinea Pig (cy3) (1:1000) purchased from Jackson Immunoreseach Laboratories Inc. Donkey anti-Mouse (Alexa Fluor 488) (1:1000), Donkey anti-Rabbit (Alexa Fluor 594) (1:1000) purchased from Invitrogen All antibodies were stored at 4 °C. |
||
24-well plate | Corning COSTAR | 3473 | ultralow attachment 24-well plate |
O.C.T. | Tissue Tek, Sakura | 4583 | Optimum Cutting Temperature |
Vectashield | Vector Labs | H1000 | Vectashield fluorescent mounting medium |
Slides | Thermo Scientific | Superfrost-Plus positively-charged slides, 25 x 75 x 1.0 mm | |
Cover Glass | VWR International | 631-0167 | 25×60 mm |
Forced draft incubator: | Lyon Electric Company | kept humid by ensuring water levels always sufficient, maintained at 38 °C | |
Cryostat | Brite, Huntingdon, UK | -36 °C | |
Tissue Culture Incubator | DH Autoflow | Nuaire 38 °C, 5% CO2 | |
Vibratome | Leica | Leica VT1000-S | |
Microscope | Nikon | Nikon Eclipse E80i fluorescence microscope | |
Digital Camera | Nikon | Nikon DS5M and Hamammatsu ORCA ER |