Vurdering af gastrisk tømning hos ikke-overvægtige diabetiske mus ved anvendelse af en [¹³ C]-octansyre Breath Test

Summary

Bestemmelse af ventrikeltømning med en non-invasiv [¹³ C]-octansyre ånde test til sporing af gastroparese hos kvindelige NOD LTJ mus.

Abstract

Gastrisk tømning af mus har været begrænset af den manglende evne til at følge mavetømning ændringer hos det samme dyr, idet de mest almindeligt anvendte teknikker kræver aflivning af dyrene og postmortem genvinding af måltidet ^1,2. Denne fremgangsmåde forhindrer forløbsundersøgelser at bestemme ændringer i ventrikeltømning med alderen og progression af sygdommen. De almindeligt anvendte ^[13 C]-octansyre-breath test for mennesker ³ er blevet modificeret til brug i mus ^4-6 og rotter ⁷ og vi tidligere viste, at denne test er pålidelig og reagerer på ændringer i mavetømning i forbindelse med lægemidler og under diabetisk sygdomsprogression ^8. I denne video præsentation princippet og praktiske gennemførelse af denne modificerede test forklares. Som i den tidligere undersøgelse, er NOD-LTJ mus anvendes, en model for type 1 diabetes ^9. En del af disse mus udvikler symptomer på gastroparese, en komplikation Diabetes karakteriseret ved forsinket gastrisk tømning uden mekanisk obstruktion af maven ^10.

Dette papir viser hvordan man træner musene til test, hvordan man kan forberede testen måltid og få 4 hr ventrikeltømning data og hvordan man analysere de opnåede data. The kulstofisotoperne analysator anvendes i den foreliggende undersøgelse er egnet til automatisk prøvetagning af luftprøver fra op til 12 mus på én gang. Denne teknik tillader den langsgående opfølgning af gastrisk tømning fra større grupper af mus med diabetes eller andre langvarige sygdomme.

Introduction

Dette håndskrift beskriver de tekniske og metodiske overvejelser, der er involveret i ikke-invasiv måling af ventrikeltømning hos mus. Ved at følge protokollen beskrevet her, kan efterforskerne pålideligt og reproducerbart følge ændringer i gastrisk tømning på grund af udvikling af sygdom, studere virkningen af farmakologiske midler på ventrikeltømning og følg reaktion af ventrikeltømning til behandling af underliggende sygdomme eller defekter ^{6,8, 11,12.} I tidligere publikationer, octansyre ånde tests anvendelsen af ¹³ C viste sig at være en nyttig måde at måle mavetømning hos mennesker og dyr ^3,8. Dette papir beskriver i detaljer, de procedurer, der er nødvendige for at få pålidelige data over 6 til 8 måned, der er nødvendige for en forløbsundersøgelse af ventrikeltømning i mus med diabetes. Fordelene ved at følge denne protokol i forhold til tidligere offentliggjorte metoder er, at undersøgeren kan sikres dataene obtained vil være pålidelig og reproducerbar. Endvidere beskrives det automatiserede system til indsamling og analyse af gasprøver her forøger antallet af dyr, der kan følges samtidigt i en undersøgelse. Overordnet er målet med dette oplæg er at identificere de vigtigste faktorer, der vedligeholder tilvænning af musene på prøve og at reducere variation i opnåede resultater.

For in vivo måling af ventrikeltømning, musene fastet natten over og lagt i gennemsigtig plast test kamre med konstant luftstrøm. Efter musene bliver vant til rørene, baseline udåndede ¹³ _CO2-niveauet bestemmes og luftstrømmen justeres i overensstemmelse hermed. Dernæst vi administrerer et testmåltid, der består af æggeblomme blandes med ^13C-mærket octansyre. Fordi musene fastes og trænes, er de generelt spiser test måltid inden 2 min. Den indgivne octansyre ikke absorberes i maven, men vil blive optaget i duodenum end vil blive metaboliseret i leveren til ¹³ CO _2, som udsendes og udåndes, hvilket resulterer i en berigelse af ¹³ _CO2 i den omgivende luft. Luft opsamles med bestemte tidsintervaller og analyseres af kulstofisotoperne analysatoren. Den hastighedsbegrænsende trin i hele denne proces er gastrisk tømning og den pulmonale udskillelse af ¹³ CO ₂ direkte svarer mavetømning af det mærkede måltid.

Figur 1. Skematisk af ventrikeltømning apparat. Efter faste natten over, anbringes musene i gennemsigtige kamre giver dem mulighed for at bevæge sig og dreje frit. Et indløbsrør tillader frisk og konstant luft indstrømning og et udløb fører til isotop analysatoren til måling af ^13C-12C-forhold i den udåndede luft. Kammeret har også en central port til afgivelse af fødevarer, der indeholder ^{[13C]-octansyre.}

Protocol

1. Uddannelse og Tilvænning af Mus Før analyse sætte alle mus i prøvningen kamre i 2-4 timer med konstant luftstrøm for at vænne dem til de testbetingelser. Dette reducerer markant stressniveauet, der ellers kunne forårsage afvigende påvisning af forsinket ventrikeltømning. Behandl musene på samme måde, som hvis ventrikeltømning eksperimentet kører. Forbered æggeblomme (se nedenfor) uden tilsætning af octansyre og foder 0,2 g til hver mus. Gentag denne proces indtil musene er tilstræ…

Representative Results

Et repræsentativt datasæt fra tre forskellige mus er vist i figur 2. Den sorte kurven repræsenterer de datapunkter fra en mus med normale mavetømning. Det viser fraktionen af 13C, som genvindes i den udåndede luft udtrykt som en procentdel af den indgivne dosis per time udtrykt som en funktion af tiden. Den blå kurve er fra en mus med en fremskyndet gastrisk tømning med en T halv værdi af 40 min, og den røde kurve er fra en mus med en forsinket ventrikeltømning med en T halv værdi …

Discussion

Den beskrevne teknik heri muliggør gentagen og ikke-invasiv in vivo måling af faststof gastrisk tømning hos mus. Dette system har den fordel, at dyrene ikke er fastholdt i målekammeret, så de kan bevæge sig og dreje frit. Da dette er et ukendt miljø, musene stadig nødt til at være uddannet og vant til test kamre for at undgå virkningerne af stress på ventrikeltømning. I almindelighed antager vi de mavetømning data er pålidelige, hvis den intra-mus variabilitet mellem på hinanden følgende mavetø…

Materials

NAME	COMPANY	CAT NUMBER	COMMENTS
A source of constant air-supply, flow as well as composition	central air supply in the research facility
130 ml sampling chamber that has air inlet, air outlet, and food administration opening Plastic tubes for air supply	In-house built
Octanoic acid	Cambridge isotope laboratories (Andover, MA)	CLM-293-1
To prepare the egg meal: small beaker 50 ml plastic tube Bunsen burner egg spatula	Any supplier		Try to be consistent with the egg supplier since the nutritional content and palatability of the eggs can affect ingestion and gastric emptying of the meal
Carbon dioxide isotope analyzer	Los Gatos Research Inc. (Mountain View, CA)