Creazione di sfumature adesivi e solubile per la migrazione di imaging cellulare con microscopia a fluorescenza
Summary
Un metodo per l'assemblaggio di gradienti adesivi e solubile in una camera per gli studi di microscopia vivi migrazione cellulare è descritto. L'ambiente di ingegneria combina superfici antivegetative e le tracce adesive con pendenze soluzione e permette quindi di determinare l'importanza relativa di spunti di orientamento.
Abstract
Cellule possono percepire e migrare verso concentrazioni più elevate di stimoli adesive come le glicoproteine della matrice extracellulare e spunti solubili come fattori di crescita. Qui, descriviamo un metodo per creare gradienti opposti di segnali adesivi e solubile in una camera microfluidica, che è compatibile con imaging cellulare vivo. Un copolimero di poli-L-lisina e polietilene glicole (PEG-PLL) è impiegato per passivare coprioggetto e prevenire adsorbimento non specifico di biomolecole e cellule. Successivamente, la stampa microcontatto o litografia dip penna sono utilizzati per creare percorsi di streptavidina sulle superfici passivati per servire come punti di ancoraggio per il peptide biotinilato arginina-glicina-acido aspartico (RGD) come cue adesivo. Un dispositivo microfluidico è disposto sulla superficie modificata e utilizzata per creare il gradiente di segnali adesivi (100% allo 0% RGD RGD) sulle tracce streptavidina. Infine, lo stesso dispositivo microfluidico è usato per creare un gradiente di suc chemoattractanth come siero bovino fetale (FBS), come cue solubile in direzione opposta del gradiente di segnali adesivi.
Introduction
Migrazione cellulare Regia è una proprietà fondamentale di molte cellule ed è un aspetto fondamentale di molti processi fisiologici, tra cui lo sviluppo embrionale, la difesa contro le infezioni e guarigione della ferita. Inoltre, la migrazione cellulare gioca anche un ruolo importante in molte malattie quali malattia vascolare, cellule tumorali e metastasi 1,2 infiammazione cronica. Mentre gli stati classici della migrazione cellulare – polarizzazione, estensione protrusione, la formazione di adesione, la generazione di forza e retrazione posteriore – sono generalmente accettate 3,4, la delucidazione dei meccanismi spazio-temporali da cui esso è coordinato integrazione del segnale è stato più impegnativo.
La matrice extracellulare (ECM) serve come substrato per l'adesione cellulare, e attraverso chimica e fisica inerente 5 6 diversità, fornisce indicazioni direzionali per cella 7,8 navigazione. In aggiunta a questi segnali adesive 9, fattori solubili 10-12 </ Sup>, come chemochine e fattori di crescita in grado di indurre la migrazione delle cellule attraverso i recettori chemiotattico diretto e la loro segnalazione a valle motogenic. Attualmente, non è noto se l'impegno e segnalamento attraverso recettori di adesione integrine (cioè) o recettori chemoattraente, come recettore tirosina chinasi (RTK), sono dominanti. Non è neppure noto se gerarchie di sistemi recettoriali sono tipo specifico delle cellule.
Microscopia di cellule in diretta dà una ricchezza di informazioni che non è accessibile nei test di massa e può essere combinato con dispositivi microfluidici per generare gradienti immobilizzati di spunti 13,14 e solubile 15 16. Il metodo qui descritto utilizza una serie di semplici passaggi e consolidata per modificazione superficiale in combinazione con una camera disponibile in commercio microfluidica per creare un saggio di imaging per la migrazione cellulare che può essere facilmente implementato in un laboratorio di biologia cellulare (Figura 1). L'assemblatodispositivo a microfluidi ha qualità ottiche che sono paragonabili al vetro 17 e il gradiente di molecole diffusibili sono stabili per almeno 16 ore. Il sistema può essere utilizzato per tecniche epifluorescenza e avanzate. A differenza di altre configurazioni chemiotassi 18, questo sistema è adatto per la registrazione lenta migrazione, cellule aderenti. Importante, il sistema è modulare e permette facilmente l'introduzione di adesivo alternativa o segnali migrazione solubili e l'esame di vari tipi cellulari.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo utilizzato un dispositivo disponibile in commercio microfluidica (sticky-Slide chemiotassi 3D Ibidi) per studiare gli effetti delle superfici chimicamente modificati e le sfumature chemoattractant sulla migrazione delle cellule. Questa configurazione microfluidica non richiede un flusso perché il gradiente è stabilito per diffusione lungo la lunghezza del canale. Questo è importante perché il flusso differenziale potrebbe influenzare le cellule migrano lentamente come i fibro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il finanziamento della Australian Research Council e National Health and Medical Research Council of Australia e anche ringraziare la Australian National impianto di produzione per il SU-8 master per la stampa microcontatto. SHN è sostenuta dal Ministero dell'Istruzione Superiore e Malesia Universiti Sains Malaysia.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Coverglass staining outfits | Thomas Scientific | 8542 E40 | Coverslip rack |
| Oven | Binder | ED 53 series | |
| Silicon wafer | Silicon Quest | 708-007 | Boron doped <100> wafer, 4″ diameter, 500 μm, single side polished |
| GM1070 SU-8 photoresist | Gersteltec Sarl | ||
| SU-8 developer | Gersteltec Sarl | ||
| Sylgard 184 curing agent | Dow Corning | ||
| Sylgard 184 elastomer prepolymer | Dow Corning | ||
| PLL-PEG-biotin (20%) | SuSos AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotin (20%) | 1 mg/ml in PBS |
| Fluorescein | Sigma | 46955 | 1 mM in PBS |
| Streptavidin-AlexaFluor350 | Invitrogen | S-11249 | 1 mg/ml in PBS |
| Biotin-4-fluorescein | Invitrogen | B-1370 | 0.03 μg/μl in PBS |
| Biotin-RGD | GenScript | SC1208 | 0.03 mg/ml in PBS |
| Syto 64 Red | Invitrogen | S-11346 | 1 μM in PBS |
| Sticky slide chemotaxis 3D | Ibidi | 80328 | |
| 200 μl Greiner yellow bevelled tip | Greiner Bio-One | 739261 | |
| Vaseline | Sigma | 16415 | |
| Paraffin wax, mp 55-57 °C | Sigma | 327204 | |
| Nano eNabler 10 μm cantilever | BioForce | SPT-S-C-10s | |
| Image J software | National Institute of Health | rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| Manual Tracking plugin | Fabrice Cordelières | rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | |
| Chemotaxis and Migration Tool | Ibidi GmbH | www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html |
Referências
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